【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶催化工程，具体涉及一种制备高纯度葡寡五糖的方法。
技术介绍
1、与高聚合度β-1,3-葡聚糖相比，小分子β-1,3-葡寡糖易溶于水，具有更高的生物活性，利用专一性内切型β-1,3-葡聚糖酶酶解，可得到β-1,3-葡寡五糖为主要成分的小分子β-1,3-葡寡糖。该酶的催化凹槽的末端存在一个独特的底物结合区(β22和β27)，该区域存在三个具有较长侧链的氨基酸残基(his245，tyr406和glu408)，这些氨基酸残基位于蛋白的表面，形成一段隆起区域。这一隆起区域围绕在底物的还原末端，对底物结合形成了空间位阻。正是由于这一空间位阻的存在，该的催化凹槽适宜于从还原末端结合三股螺旋β-1,3-葡聚糖底物。这一结合方式使得三股螺旋β-1,3-葡聚糖的糖链正好被该酶的两个活性中心(glu236：广义酸；asp 252：广义碱)所催化，水解断裂生成五糖单位。这一催化方式类似于外切型糖苷水解酶，即从底物的末端逐个切下产物。但由于his245，tyr406及glu408形成的空间位阻并不足以完全封闭催化凹槽，因此三股螺旋β-1,3-葡聚糖仍然可以以其他位点随机结合于该酶的催化凹槽，从而也可遵循内切型糖苷水解酶的催化机制从糖链内部切断三股螺旋β-1,3-葡聚糖底物。因此形成以β-1,3-葡寡五糖为主要成分，主要成分的分子量在689.159～2308.564da，聚合度在4-14的寡糖产物。
2、β-1,3-葡寡五糖是由5个葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接，具有独特的作用。有研究表明β-1,3-葡寡五糖可以与白细胞c型凝集
3、目前有制备聚合度在2-14的β-1,3-葡寡糖的一些方法，但都聚合度分布都较广，没有纯度较高的β-1,3-葡寡五糖的生产方法。
技术实现思路
1、本专利技术主要目的在于，提供一种制备高纯度葡寡五糖的方法。采用本专利技术所述方法能够制备得到99％以上高纯度的β-1,3-葡寡五糖。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术提供一种制备高纯度葡寡五糖的方法，所述方法包括以下步骤：
4、将β-1,3-葡聚糖原料制成悬浊液，调节ph，加入1,3-β-d-葡聚糖内切酶进行酶解；酶解结束后离心，收集上清液，得粗样品溶液；将所得粗样品溶液依次经过滤膜过滤、脱色后，将上清液进行浓缩，得到浓缩液；
5、将所得浓缩液用凝胶层析柱进行洗脱，收集洗脱液；采用tlc快速检测洗脱液中葡寡糖种类，将收集的含葡寡五糖的洗脱液进行冷冻、干燥，即得β-1,3-葡寡五糖。
6、进一步地，将β-1,3-葡聚糖原料制成固形物含量为40～100g/l的悬浊液，调节ph为4.5～6.0。
7、进一步地，酶解时，所用酶加入量为0.5～3u/ml。
8、进一步地，酶解反应条件为：50～60℃酶解2.5～3.5h，随后升温至80～90℃灭酶20～30min，待降至室温后调节ph为6.8～7.0。
9、进一步地，酶解结束后4000～8000rpm离心10～30min，收集上清液。
10、进一步地，所用滤膜孔径为20～100nm。
11、进一步地，将所得粗样品溶液依次经过滤膜过滤、脱色后，将上清液中酶解产物β-1,3-葡寡糖浓缩至固形物含量40％～70％。
12、进一步地，采用凝胶层析柱进行洗脱时，上样量为0.5～10ml，用双重蒸馏水洗脱，流速为6～60ml/h；用自动部分收集器每3～10ml收集一管。
13、进一步地，所述凝胶层析柱内径为：1～5cm；层析凝胶选用聚丙烯酰胺凝胶bio-gel p-2，水合后膨胀3倍，粒径为40～95μm。
14、进一步地，tlc快速检测所用硅胶板为merck 1.05729，点样量为1～3μl，以0.5～5g/l质量浓度的五聚糖右旋糖苷酐溶液为对照，展开距离为10～15cm，展开剂为乙酸、乙酸乙酯、水的混合溶液，显色剂为乙醇-硫酸-地衣酚显色剂，显色方法为90～95℃显色。
15、与现有技术相比，本专利技术具有以下技术优势：
16、本专利技术选用1,3-β-d-葡聚糖内切酶对β-1,3-葡聚糖进行酶解，所得酶解液中β-1,3-葡寡五糖含量高，含量在68％～75％；再采用聚丙烯酰胺凝胶bio-gel p-2纯化分离后，β-1,3-葡寡五糖纯度可达95％～99.9％。本专利技术有效制备得到了高纯度β-1,3-葡寡五糖。
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1.一种制备高纯度葡寡五糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将β-1,3-葡聚糖原料制成固形物含量为40～100g/L的悬浊液，调节pH为4.5～6.0。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶解时，所用酶加入量为0.5～3U/mL。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶解反应条件为：50～60℃酶解2.5～3.5h，随后升温至80～90℃灭酶20～30min，待降至室温后调节pH为6.8～7.0。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶解结束后4000～8000rpm离心10～30min，收集上清液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所用滤膜孔径为20～100nm。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将所得粗样品溶液依次经过滤膜过滤、脱色后，将上清液中酶解产物β-1,3-葡寡糖浓缩至固形物含量40％～70％。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，采用凝胶层析柱进行洗脱时，上样量为0.5～10mL，用双重蒸馏水洗脱，流速为6
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述凝胶层析柱内径为：1～5cm；层析凝胶选用聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-2，水合后膨胀3倍，粒径为40～95μm。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，TLC快速检测所用硅胶板为Merck 1.05729，点样量为1～3μL，以0.5～5g/L质量浓度的五聚糖右旋糖苷酐溶液为对照，展开距离为10～15cm，展开剂为乙酸、乙酸乙酯、水的混合溶液，显色剂为乙醇-硫酸-地衣酚显色剂，显色方法为90～95℃显色。
...【技术特征摘要】
1.一种制备高纯度葡寡五糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将β-1,3-葡聚糖原料制成固形物含量为40～100g/l的悬浊液，调节ph为4.5～6.0。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶解时，所用酶加入量为0.5～3u/ml。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶解反应条件为：50～60℃酶解2.5～3.5h，随后升温至80～90℃灭酶20～30min，待降至室温后调节ph为6.8～7.0。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，酶解结束后4000～8000rpm离心10～30min，收集上清液。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所用滤膜孔径为20～100nm。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，将所得粗样品溶液...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁建国，吉武科，焦慧文，高艳华，
申请(专利权)人：山东国力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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