【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因测序，具体涉及一种独立上机测序的甲基化文库及其构建方法。
技术介绍
1、对于甲基化文库的测序，由于非甲基化的c碱基转换为t碱基，导致甲基化文库的碱基不平衡，无法实现独立上机测序。目前主要通过在甲基化文库测序时加入平衡文库的方法增加测序过程中碱基复杂度，保证测序质量。常见的平衡文库一般是选择4种碱基(a、t、c、g)分布均衡的特定物种基因组dna制备而成，gc含量在41％-74％，比如illumina公司的phix文库(gc含量44％)、人基因组平衡文库(gc含量41％)(专利申请号201710378056.4)、大肠杆菌dna做成的平衡文库(gc含量50％)或放射性耐动球菌(kineococcus radiotolerans)的基因组文库(gc含量74％)(suzuki et al.2018)等。不同测序平台需要加入20％-40％比例不等的平衡文库，比如illumina的hiseq系列测序仪推荐至少加入20％的平衡文库。平衡文库的加入虽然大幅提高了甲基化文库的测序质量，但是也会造成数据浪费，增加测序成本。
2、通过加入平衡文库改善甲基化文库测序数据质量的方法具有如下不足之处：1)平衡文库会占据20％-40％的数据量，增加了测序成本；2)平衡文库的构建依赖于对病毒、细菌或细胞的培养和dna提取、文库构建和质控等实验环节，需要投入大量的生产成本；3)平衡文库与甲基化文库的最佳混合比例会受到测序平台、建库方法、两种文库的插入片段长度的影响，降低了测序数据产出的稳定性。
3、有鉴于此，特提出本专
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种独立上机测序的甲基化文库及其构建方法，本专利技术构建得到的甲基化文物解决了文库测序碱基不平衡，需要加入碱基平衡文库才能测序，从而导致测序成本增加以及测序稳定性降低的问题。
2、为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了一种独立上机测序的甲基化文库构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
4、(a)采用a接头对dna片段进行甲基化文库的构建，得到文库a；
5、(b)采用b接头对dna片段进行甲基化文库的构建，得到文库b；
6、(c)将文库a和文库b进行混合，即得所述独立上机测序的甲基化文库；
7、若所述a接头的reads1测序引物结合区域与dna片段的5’端连接，则所述b接头的reads1测序引物结合区域与dna片段的3’端连接；
8、若所述a接头的reads1测序引物结合区域与dna片段的3’端连接，则所述b接头的reads1测序引物结合区域与dna片段的5’端连接。
9、优选地，所述构建方法还包括：对所述a接头和b接头中的c碱基进行甲基化修饰。
10、优选地，所述a接头包括长链a和短链a；
11、所述长链a的核苷酸序列如seq id no.1所示；
12、所述短链a的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13、优选地，所述长链a的5’端的a碱基进行磷酸化修饰。
14、优选地，所述b接头包括长链b和短链b；
15、所述长链b的核苷酸序列如seq id no.3所示；
16、所述短链b的核苷酸序列如seq id no.4所示。
17、优选地，所述长链b的5’端的a碱基进行磷酸化修饰。
18、优选地，所述文库a和文库b按照等质量混合。
19、优选地，所述步骤(a)和步骤(b)中的dna片段相同或不同。
20、本专利技术第二方面提供了一种所述构建方法构建得到的独立上机测序的甲基化文库。
21、与现有技术相比，本专利技术的有益效果至少包括：
22、本专利技术构建得到的甲基化文库不需要加入平衡文库即可实现上机测序，减少了平衡文库制备成本和测序成本；同时提高了甲基化文库测序的稳定性，不需要考虑平衡文库与甲基化文库的混合比例问题，减少实验失败风险；此外，本专利技术构建方法提升了甲基化文库测序的灵活性，可以实现甲基化文库单独上机测序。
23、此外，本专利技术构建得到的甲基化文库能够运用到illumina、thermofisher、pacbio、oxford nanopore technologies、真迈生物、安图生物、赛陆医疗等其他测序平台；另外，本专利技术甲基化建库方法适用于短接头连接与index pcr相结合的双链建库方法，各种单链建库方法，两步多重pcr产物建库方法等，只要能够实现插入片段的5’端或3’端加上reads1的测序引物结合序列即可。
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1.一种独立上机测序的甲基化文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：对所述A接头和B接头中的C碱基进行甲基化修饰。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(a)中，A接头包括长链A和短链A；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述长链A的5’端的A碱基进行磷酸化修饰。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(b)中，B接头包括长链B和短链B；
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述长链B的5’端的A碱基进行磷酸化修饰。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(c)中，文库A和文库B按照等质量混合。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(b)中的DNA片段相同或不同。
9.权利要求1～8中任一所述的构建方法构建得到的独立上机测序的甲基化文库。
【技术特征摘要】
1.一种独立上机测序的甲基化文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：对所述a接头和b接头中的c碱基进行甲基化修饰。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(a)中，a接头包括长链a和短链a；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述长链a的5’端的a碱基进行磷酸化修饰。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑建超，
申请(专利权)人：深圳东亿医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：
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