【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物转基因dna重组，尤其涉及一种农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法。
技术介绍
1、常绿蓝莓（拉丁学名： vaccinium darrowii），杜鹃花科（ericaceae）越橘属（vaccinium）常绿灌木，是一种蓝莓野生种。与蓝莓商品种（倍性复杂）相比，常绿蓝莓在遗传学上具明显的优势：基因组简单（二倍体）、童期短（研究周期短）、且在蓝莓育种史上有重要的作用（与北方高丛蓝莓杂交培育出南方高丛蓝莓品种）。因此，常绿蓝莓被广泛用作科学研究的模式蓝莓，但是其植物组织再生困难，转基因体系一直无法建立。
2、在蓝莓转基因研究报道中，主要以多倍体蓝莓为实验材料进行外源基因的遗传转化，二倍体蓝莓还未见报道。1996年，有研究员对蓝莓品种north country进行转基因实验，获得了含gus基因的阳性植株，建立了north country的遗传转化体系（graham j, greigk, mcnicol rj. transformation of blueberry without antibiotic selection[j].annals of applied biology,1996,128(3):557-564.）。1998年，cao等人以北方高丛蓝莓和南方高丛蓝莓腋芽为研究材料进行转基因研究，发现共培养条件、菌株的选择及基因型等均影响遗传转化效率（cao, x., et al. "gus expression in blueberry (vac
3、常绿蓝莓是二倍体蓝莓，具有巨大的研究优势。然而与其他的蓝莓不同，常绿蓝莓的组织再生非常困难。其三个主要困难为：（1）常绿蓝莓在组培瓶中不长大，出现僵苗的问题；（2）常绿蓝莓外植体只长愈伤组织、不长再生芽的问题；（3）外植体接触农杆菌后快速褐化的问题。
4、转基因体系是基因功能研究的重要技术，也是科研服务公司的主营项目之一。随着蓝莓研究的迅速发展，蓝莓转基因的市场需求也逐渐增大。因此，有必要提供一种针对常绿蓝莓的转基因体系的构建方法，助力蓝莓研究和提供转基因服务。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，该方法实现了常绿蓝莓外植体的遗传转化，弥补了本领域技术空白，在用时较短的时间内，快速获得了常绿蓝莓转基因体系。
2、具体技术方案如下：
3、一种农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，包括：
4、（1）将含有功能基因的发根农杆菌加入至液体培养基中，制备得到侵染液；
5、所述液体培养基的配方为：wpm + 2% 蔗糖 + 0.1 mg/l iba + 0.4 mg/l cppu +20 mg/l 乙酰丁香酮，ph = 5.2±0.02；
6、（2）以无菌条件下生长的常绿蓝莓苗的嫩芽作为外植体，将外植体放入侵染液中进行真空渗透处理后，置于共培养培养基上进行共培养；
7、所述共培养培养基的配方为：wpm + 2% 蔗糖 + 8.5 g/l 琼脂 + 0.05 mg/l iba+ 0.2 mg/l cppu + 20 mg/l 乙酰丁香酮，ph = 5.2±0.02；
8、（3）再将共培养后的外植体洗菌后，放置于再生培养基上进行再生培养；再生培养15d~20d后，外植体陆续长出转基因愈伤组织，并出现芽点；
9、所述再生培养基的配方为：wpm + 2% 蔗糖 + 8.5 g/l 琼脂 + 0.05 mg/l iba +0.2 mg/l cppu + 300 mg/l carb + 100 mg/l tim，ph = 5.2 ± 0.02；
10、（4）每隔14~16 d更换一次再生培养基，进行继代培养，实验进行45d~60d后，外植体上长出成簇转基因芽，得到常绿蓝莓转基因体系。
11、本专利技术在常绿蓝莓转基因体系建立的前期进行了大量的实验摸索，实验初期经过多次遗传转化只能得到转基因的常绿蓝莓愈伤组织，始终无法获得转基因的常绿蓝莓植株，最后通过“真空渗透处理+培养基（尤其是共培养培养基）”的配合，获得了能够再生出转基因芽的常绿蓝莓植株，从而首次建立了常绿蓝莓完整的转基因体系。
12、进一步地，步骤（1）中，先将含有功能基因的发根农杆菌菌液于27~28℃摇床摇至浑浊，2500~3000 r离心20~25 min，弃去上清液后，再将发根农杆菌菌体加入至液体培养基中。
13、进一步地，步骤（1）中，侵染液的od600为0.6~0.7。
14、进一步地，步骤（2）中，所述真空渗透处理的方法为：将外植体至于侵染液中真空浸渍2次，每次保持时间为1~2s。
15、更进一步地，步骤（2）中，所述真空渗透处理的方法为：
16、（2-1）将外植体材料置于注射器管身内，再向管身内加入步骤（1）的侵染液；
17、（2-2）接着利用注射器将管身内空气全部排出，堵住注射器的乳头，并向后拉动注射器的活塞，保持让侵染液浸泡外植体1~2s，使侵染液渗透到外植体材料体内；
18、（2-3）将上述注射器真空渗透处理方法重复一次，再将侵染液排出，夹出外植体材料。
19、进一步地，所述外植体与侵染液的质量体积比为2 g~3 g ：15 ml~20 ml。
20、进一步地，步骤（2）中，所述真空渗透侵染方法为摸索得出的最优侵染方法，真空处理次数和保持真空浸泡时间均影本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，包括：
2. 如权利要求1所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）中，先将含有功能基因的发根农杆菌菌液于27~28℃摇床摇至浑浊，2500~3000 r离心20~25 min，弃去上清液后，再将发根农杆菌菌体加入至液体培养基中。
3.如权利要求2所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）中，侵染液的OD600为0.6~0.7。
4.如权利要求1所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，所述真空渗透处理的方法为：将外植体至于侵染液中真空浸渍2次，每次保持时间为1~2s。
5.如权利要求4所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，所述真空渗透处理的方法为：
6. 如权利要求5所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，所述外植体与侵染液的质量体积比为（2 g~3 g）：（15 mL~20 mL）。
7.如权利要求1所
8. 如权利要求1所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（3）中，所述洗菌的方法为：先利用洗菌液清洗共培养后的外植体1次，再无菌水清洗3次，然后用洗菌液浸泡10~15 min，最后吹干外植体表面的水分；
9. 如权利要求1所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中，所述再生培养的条件为：24℃条件下光照培养16 h。
...【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，包括：
2. 如权利要求1所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）中，先将含有功能基因的发根农杆菌菌液于27~28℃摇床摇至浑浊，2500~3000 r离心20~25 min，弃去上清液后，再将发根农杆菌菌体加入至液体培养基中。
3.如权利要求2所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（1）中，侵染液的od600为0.6~0.7。
4.如权利要求1所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，所述真空渗透处理的方法为：将外植体至于侵染液中真空浸渍2次，每次保持时间为1~2s。
5.如权利要求4所述的农杆菌介导的常绿蓝莓转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤（2）中，所述真...
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