【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及一种可作用于dna的腺苷脱氨酶及其应用。更具体而言，本专利技术提供了可以作用于dna腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的腺苷脱氨酶，基于该腺苷脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑系统及其应用。使用该碱基编辑系统对生物体基因组中的靶序列进行碱基编辑的方法，以及通过所述方法产生的经遗传修饰的生物体及其后代。
技术介绍
1、碱基编辑(base editing)是指通过基因工程手段对特定dna位点进行核苷酸替换的过程，碱基编辑是基因编辑(genome editing)技术的一种。在植物中，许多优良的农艺性状是由单核苷酸变异(single nucleotide variation，snv)产生的；在人体和动物中，许多遗传疾病是由功能基因上的点突变引起的。碱基编辑技术，可以对动植物、微生物的基因组dna进行靶向修饰和改造，以创制新的基因型并获得有益于生产应用的目标性状，也可在遗传疾病治疗中被用于纠正一些严重的先天性遗传变异，因而碱基编辑在优良种质创制和疾病治疗中具有重要的应用前景。
2、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，abe)是最重要的碱基编辑系统之一。2017年，abe碱基编辑系统被首次报道并成功在哺乳动物细胞中实现高效的碱基编辑(gaudelli,n.m.et al.programmable base editing of a*t to g*c in genomic dnawithout dna cleavage.nature 551,464-471(2017).)。该系统包
3、abe碱基编辑的关键在于使用能够作用于dna的腺苷脱氨酶。然而，天然的腺苷脱氨酶的作用底物是rna而非dna，因此无法对dna进行脱氨。为了解决这个问题，研究人员以来源于大肠杆菌的trna腺苷脱氨酶tada为底盘蛋白，进行多轮的蛋白质进化，最终获得了能够作用于dna的腺苷脱氨酶tada*7.10，并实现了a-t碱基对向g-c碱基对的转换。虽然研究人员在tada*7.10基础上又引入了一些新的氨基酸突变，获得了一些新的有效突变体，如tada-8e，tada-8s等。但这些腺苷脱氨酶仍然是源于大肠杆菌的trna脱氨酶。
4、自2017年abe系统被首次报道以来，领域内使用的腺苷脱氨酶均基于大肠杆菌tada，尚无其他可用的dna的腺苷脱氨酶底盘被报道。因此，寻找可以作用于dna的腺苷脱氨酶底盘，对于扩充现有的腺苷碱基编辑系统、开发精确操作目标dna序列的基因编辑工具具有极其重要的意义。
技术实现思路
1、为解决目前腺苷脱氨酶类型单一、应用场景有限、编辑效率低等问题，本申请专利技术人经过大量实验和探索，出人意料地发现了新型的腺苷脱氨酶，上述脱氨酶可作用于dna中的腺苷。基于这一发现，专利技术人开发出新型的腺嘌呤碱基编辑器，丰富了腺嘌呤碱基编辑器的应用场景和选择。
2、用于解决问题的方案
3、在本专利技术的第一方面中，提供了一种腺苷脱氨酶，所述腺苷脱氨酶能够使dna中腺嘌呤碱基脱氨基，所述腺苷脱氨酶选自以下(i)～(iii)中的一种或多种：
4、(i)包含与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且其保留如seqid no:4所示的氨基酸序列的脱氨活性；
5、(ii)包含在seq id no:4所示的氨基酸序列的c端增加连续的氨基酸的氨基酸序列，并且其保留如seq id no:4所示的氨基酸序列的脱氨活性；或
6、(iii)包含任意两个以上如(i)或(ii)中所述的氨基酸序列构成的多聚体。
7、在一些实施方案中，在(ii)中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4的c端增加至少8个连续的氨基酸的氨基酸序列。
8、在一些实施方案中，在(ii)中，所述腺苷脱氨酶包含如seq id no:5所示的氨基酸序列。
9、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并保留如seq idno:4所示的氨基酸序列的脱氨活性。
10、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有w71x突变的氨基酸序列，其中x是除w(色氨酸)之外的任何氨基酸，优选的，x是y(酪氨酸)。
11、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有a91x突变的氨基酸序列，其中x是除a(丙氨酸)之外的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，x是t(苏氨酸)。
12、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有v80x突变的氨基酸序列，其中x是除v(缬氨酸)之外的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，x是t(苏氨酸)。
13、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有s122x突变的氨基酸序列，其中x是除s(丝氨酸)之外的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，x是g(甘氨酸)。
14、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含选自在seq id no:4或seq id no:5中具有w71y突变、a91t突变、v80t突变和s122t突变中的一个或多个突变的氨基酸序列。
15、在一些实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有w71y突变和另一种腺嘌呤脱氨酶的突变的氨基酸序列。
16、在一些具体的实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有w71y和a91t突变的氨基酸序列。
17、在一些具体的实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有w71y和v80t突变的氨基酸序列。
18、在一些具体的实施方案中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seq id no:5中具有w71y和s122t突变的氨基酸序列。
19、在一些实施方案中，在(iii)中，所述多聚体包含任意两个如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列构成的二聚体，所述任意两个如(i)和(ii)中所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种腺苷脱氨酶，所述腺苷脱氨酶能够使DNA中腺嘌呤碱基脱氨基，所述腺苷脱氨酶选自以下(i)～(iii)中的一种或多种：
2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQ IDNO:4的C端增加至少8个连续的氨基酸的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的腺苷脱氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脱氨酶包含如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并保留如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的脱氨活性。
5.根据权要求4所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQ ID NO:4或SEQID NO:5中具有W71X突变的氨基酸序列，其中X是除W(色氨酸)之外的任何氨基酸，优选的，X是Y(酪氨酸)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQ IDNO:4或
7.根据权利要求6所述的腺苷脱氨酶，其中，X是T(苏氨酸)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5中具有V80X突变的氨基酸序列，其中X是除V(缬氨酸)之外的任何氨基酸。
9.根据权利要求8所述的腺苷脱氨酶，其中，X是T(苏氨酸)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQID NO:4或SEQ ID NO:5中具有S122X突变的氨基酸序列，其中X是除S(丝氨酸)之外的任何氨基酸。
11.根据权利要求10所述的腺苷脱氨酶，其中，X是G(甘氨酸)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含选自在SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中具有W71Y突变、A91T突变、V80T突变和S122T突变中的一个或多个突变的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQID NO:4或SEQ ID NO:5中具有W71Y突变和另一种腺嘌呤脱氨酶的突变的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQID NO:4或SEQ ID NO:5中具有W71Y和A91T突变的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQID NO:4或SEQ ID NO:5中具有W71Y和V80T突变的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在SEQID NO:4或SEQ ID NO:5中具有W71Y和S122T突变的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，在(iii)中，所述多聚体包含任意两个如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列构成的二聚体，所述任意两个如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列通过接头连接。
18.根据权利要求17所述的腺苷脱氨酶，其中，所述接头包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的腺苷脱氨酶用于在生物体或生物体细胞中进行基因编辑中的用途，或者在制备用于在生物体或生物体细胞中进行基因编辑的试剂中的用途。
20.一种融合蛋白，其包含：
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中，所述核酸靶向结构域为TALE、ZFP或CRISPR效应蛋白结构域。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述CRISPR效应蛋白选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cm...
【技术特征摘要】
1.一种腺苷脱氨酶，所述腺苷脱氨酶能够使dna中腺嘌呤碱基脱氨基，所述腺苷脱氨酶选自以下(i)～(iii)中的一种或多种：
2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脱氨酶包含在seq idno:4的c端增加至少8个连续的氨基酸的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的腺苷脱氨酶，其中，在(ii)中，所述腺苷脱氨酶包含如seq idno:5所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seq idno:4或seq id no:5所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并保留如seq id no:4所示的氨基酸序列的脱氨活性。
5.根据权要求4所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seq id no:4或seqid no:5中具有w71x突变的氨基酸序列，其中x是除w(色氨酸)之外的任何氨基酸，优选的，x是y(酪氨酸)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seq idno:4或seq id no:5中具有a91x突变的氨基酸序列，其中x是除a(丙氨酸)之外的任何氨基酸。
7.根据权利要求6所述的腺苷脱氨酶，其中，x是t(苏氨酸)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seq idno:4或seq id no:5中具有v80x突变的氨基酸序列，其中x是除v(缬氨酸)之外的任何氨基酸。
9.根据权利要求8所述的腺苷脱氨酶，其中，x是t(苏氨酸)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seqid no:4或seq id no:5中具有s122x突变的氨基酸序列，其中x是除s(丝氨酸)之外的任何氨基酸。
11.根据权利要求10所述的腺苷脱氨酶，其中，x是g(甘氨酸)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含选自在seq id no:4或seq id no:5中具有w71y突变、a91t突变、v80t突变和s122t突变中的一个或多个突变的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seqid no:4或seq id no:5中具有w71y突变和另一种腺嘌呤脱氨酶的突变的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seqid no:4或seq id no:5中具有w71y和a91t突变的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seqid no:4或seq id no:5中具有w71y和v80t突变的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，所述腺苷脱氨酶包含在seqid no:4或seq id no:5中具有w71y和s122t突变的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的腺苷脱氨酶，其中，在(iii)中，所述多聚体包含任意两个如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列构成的二聚体，所述任意两个如(i)和(ii)中所述的氨基酸序列通过接头连接。
18.根据权利要求17所述的腺苷脱氨酶，其中，所述接头包含如seq id no:30所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的腺苷脱氨酶用于在生物体或生物体细胞中进行基因编辑中的用途，或者在制备用于在生物体或生物体细胞中进行基因编辑的试剂中的用途。
20.一种融合蛋白，其包含：
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中，所述核酸靶向结构域为tale、zfp或crispr效应蛋白结构域。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述crispr效应蛋白选自cas3、cas4、cas5、cas5e(或casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9、cas10、cast10d、cas12、cas13、cas14、casx、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1(或casa)、cse2(或casb)、cse3(或case)、cse4(或casc)、csc1、csc2、csa5、csn1、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cpf1、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csz1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf...
【专利技术属性】
技术研发人员：高强，
申请(专利权)人：北京齐禾生科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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