【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学的，尤其涉及一种重组dna聚合酶、制备方法、试剂盒及在探针法qpcr扩增中的应用。
技术介绍
1、qpcr技术指的是在传统聚合酶链式反应的基础上引入荧光化学物质，通过对反应体系中荧光信号强度的变化的检测，实现对扩增产物的定量检测的一项技术，其被广泛应用于如临床疾病诊断、环境样品检测、食品安全检测以及生物研究等生命科学的各个领域。
2、根据qpcr技术中荧光信号的产生方式，可将其分为染料法qpcr和探针法qpcr。其中，染料法qpcr的成本低，但是反应中所存在的非特异性扩增对于检测结果有特别大的影响，假阳性率高。相较于染料法qpcr，探针法qpcr中利用带有荧光化学物质的探针对于目标序列的特异性结合能力，可有效地降低反应中所存在的非特异性扩增对于检测结果的影响，具有高特异性、高准确性以及耗时短等优点，因而被更加广泛地应用于生物医学诊断、病原菌检测、农业科学、食品安全等领域中。
3、目前，探针法qpcr中所采用的dna聚合酶为taq dna聚合酶，其具有5'-3'核酸外切酶活性，能够在dna链延伸的过程中降解结合于目标序列上的探针，使得荧光猝灭基团和荧光报告基团分离，从而产生荧光信号。但是，该taq dna聚合酶的抗抑制能力差且热稳定性不甚理想，无法很好地应用于复杂样本的探针法qpcr检测中，具有较大的局限性。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的是为了解决现有探针法qpcr中所存在的dna聚合酶抗抑制能力差且热稳定性较低的问题，而提供
2、本专利技术的第二目的是为了提供上述重组dna聚合酶的制备方法。
3、本专利技术的第三目的是为了提供上述重组dna聚合酶在探针法qpcr扩增中的应用。
4、具体的，本专利技术提供的重组dna聚合酶包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段和/或与seq id no:1所示氨基酸片段具有90％以上同源性的变体序列。
5、进一步地，所述重组dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
6、本专利技术提供的上述重组dna聚合酶的制备方法包括：s1、取所述重组dna聚合酶的编码基因重组至质粒载体上，得到重组质粒；s2、取所述重组质粒导入至宿主细胞内，得到酶表达菌株；s3、取所述酶表达菌株进行诱导表达，得到所述重组dna聚合酶。
7、进一步地，步骤s1中，所述重组dna聚合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
8、进一步地，步骤s1中，所述质粒载体选自pet-28a、pet-24a、pet-24b和pet-24c中的一种或多种。
9、进一步地，步骤s2中，所述宿主细胞选自大肠杆菌dh5α、大肠杆菌bl21和大肠杆菌bl21(de3)中的一种或多种。
10、进一步地，步骤s3中，所述诱导表达包括：取所述酶表达菌株进行扩大培养，得到种子液；取诱导表达剂加入至种子液中进行诱导表达培养，得到所述重组dna聚合酶。
11、进一步地，所述扩大培养的酶表达菌株接种量为1～3％，温度为35～40℃，时间为12～48h。
12、进一步地，所述诱导表达剂为iptg，添加终浓度为0.05～0.2mm。
13、进一步地，所述诱导表达培养的温度为25～30℃，时间为16～18h。
14、本专利技术还提供了上述重组dna聚合酶在探针法qpcr扩增中的应用。
15、本专利技术提供的探针法qpcr扩增反应试剂盒包括上述的重组dna聚合酶。
16、有益效果：
17、本专利技术提供的重组dna聚合酶包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段和/或与seq id no:1所示氨基酸片段具有90％以上同源性的变体序列，该重组dna聚合酶具有优秀的抗抑制能力和热稳定性，能够很好地被应用于探针法qpcr中实现对待测样品中目标序列的定性、定量检测，尤其是对于复杂样本也具有良好的检测效果，在临床诊断、食品安全检测上等领域的应用中均具有重要意义。
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1.一种重组DNA聚合酶，其特征在于，所述重组DNA聚合酶包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段和/或与SEQ ID NO:1所示氨基酸片段具有90％以上同源性的变体序列。
2.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其特征在于，所述重组DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1或2所述的重组DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：S1、取所述重组DNA聚合酶的编码基因重组至质粒载体上，得到重组质粒；S2、取所述重组质粒导入至宿主细胞内，得到酶表达菌株；S3、取所述酶表达菌株进行诱导表达，得到所述重组DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的重组DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述重组DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3所述的重组DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述质粒载体选自pET-28a、pET-24a、pET-24b和pET-24c中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的重组DNA聚合酶
7.根据权利要求3所述的重组DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述诱导表达包括：取所述酶表达菌株进行扩大培养，得到种子液；取诱导表达剂加入至种子液中进行诱导表达培养，得到所述重组DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的酶表达菌株接种量为1～3％，温度为35～40℃，时间为12～48h；
9.权利要求1或2所述的重组DNA聚合酶在探针法qPCR扩增中的应用。
10.一种探针法qPCR扩增反应试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的重组DNA聚合酶。
...【技术特征摘要】
1.一种重组dna聚合酶，其特征在于，所述重组dna聚合酶包括序列如seq id no:1所示的氨基酸片段和/或与seq id no:1所示氨基酸片段具有90％以上同源性的变体序列。
2.根据权利要求1所述的重组dna聚合酶，其特征在于，所述重组dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3.权利要求1或2所述的重组dna聚合酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：s1、取所述重组dna聚合酶的编码基因重组至质粒载体上，得到重组质粒；s2、取所述重组质粒导入至宿主细胞内，得到酶表达菌株；s3、取所述酶表达菌株进行诱导表达，得到所述重组dna聚合酶。
4.根据权利要求3所述的重组dna聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述重组dna聚合酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
5.根据权利要求3所述的重组dna聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述质...
【专利技术属性】
技术研发人员：易志伟，产竹华，曾润颖，杨子宜，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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