【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种多价框架核酸探针及其制备方法和细胞膜蛋白成像分析方法。
技术介绍
1、在生物学中，许多细胞膜蛋白的异常表达和疾病相关，如核仁素在许多肿瘤细胞膜表面过量表达，可以作为肿瘤生物标志物。精确监测某一膜蛋白的对揭示临床诊断和治疗中的分子机制具有重要意义。膜蛋白检测方法有荧光标记法和蛋白质印迹法等。但是荧光标记法常用的荧光探针易被细胞非特异性摄取，造成伪信号，导致数据结果不可靠。蛋白质印迹法，步骤繁琐，抗体成本高，标记所用的生物酶易失活等问题。该方法需要将细胞裂解，进行简单分离纯化，然后利用酶联免疫分析方法对所分离的蛋白粗提物进行定量分析。然而膜蛋白提取和纯化过程不可避免地存在蛋白损失，直接分析粗提蛋白或者复杂的生物样本将面临背景杂蛋白干扰，过程复杂而繁琐，从而实现细胞膜蛋白的准确分析。因此有必要发展低成本、精准可靠的膜蛋白分析方法，操作简便，便于储存应用。近年来，dna功能适配体和dna纳米技术的快速发展为生物标志膜蛋白的检测提供了有力的工具。同时，基于光学信号放大的“杂交链反应”(hcr)技术，也为细胞膜蛋白的原位成像提供了新的思路和方法。这些技术的出现和发展，为揭示细胞膜蛋白的结构和功能提供了新的机遇和挑战。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提供一种多价框架核酸探针及其制备方法和细胞膜蛋白成像分析方法，本专利技术构建的多价框架核酸探针能够对细胞膜蛋白表达量进行分析，能够解决现有膜蛋白检测方法中存在的假阳性信号的问
2、技术方案：一种基于多价框架核酸探针的制备方法，包括以下步骤：
3、步骤一、设计组成dna四面体的四条链、适配体延伸链和发夹链；
4、组成dna四面体的四条链，包括s1延伸链、s2延伸链、s3延伸链、s4引发链，其核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示；
5、发夹链，包括荧光染料fam标记的发夹链fam-h1、fam-h2，发夹链fam-h1、fam-h2的核苷酸序列分别如seq id no.5、seq id no.6所示；
6、适配体延伸链为as1411适配体延伸链，其核苷酸序列如seq id no.7所示；
7、步骤二、将组成dna四面体的四条链、适配体延伸链混合，通过退火自组装，形成多价适配体链接的dna四面体框架核酸；
8、步骤三、将多价适配体链接的dna四面体框架核酸与发夹链fam-h1、fam-h2混合，制备出多价框架核酸探针。
9、进一步的，步骤二的具体过程如下：
10、利用紫外-可见光谱分别对合成中所需的dna链进行定量，将s1延伸链、s2延伸链、s3延伸链、s4引发链、as1411适配体延伸链，按1:1:1:1:(1–3)的摩尔比例加入到tm缓冲液中，置于热循环仪中升温至95℃，维持5至10min，再在30s内降温至4℃，即可得到不同数目适配体链接的dna四面体。
11、进一步的，步骤三的具体步骤如下：
12、步骤3.1、将步骤二制备的多价适配体链接的dna四面体框架核酸与发夹链fam-h1、fam-h2按1:10:10的摩尔比例在pcr管中混合得到混合溶液，所用的缓冲液为tm缓冲液；
13、步骤3.2、将步骤3.1中的混合溶液置于37℃的水浴锅避光孵育3小时；反应结束后，取出pcr管中的混合溶液进行超滤，超滤洗涤多次以去除未连接的dna短链，最终得到基于dna四面体的hcr长链产物，即多价框架核酸探针。
14、进一步的，步骤二和步骤三中tm缓冲液的ph为8.0，含5mm mg2+。
15、进一步的，步骤3.2中，超滤操作的条件是截留分子量：100kd，离心力，3000g，离心时间：10min。
16、进一步的，步骤四中，将构建的多价框架核酸探针加入到待检测细胞的培养基中，置于4℃冰箱，1小时后，弃去培养基，用pbs洗涤三次，之后用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
17、本专利技术还公开了基于所述多价框架核酸探针的细胞膜蛋白成像分析方法，将构建的多价框架核酸探针加入到待检测细胞的培养基中，培养一段时间后，弃去培养基，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞的成像荧光。
18、进一步的，将构建的多价框架核酸探针加入到待检测细胞的培养基中，置于4℃冰箱，1小时后，弃去培养基，用pbs洗涤三次，之后用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
19、有益效果：
20、(1)本专利技术构建的基于多价框架核酸探针，引入了多价适配体，有助于降低dna四面体被内吞的概率并提高与肿瘤细胞的特异性结合，提高检测信号的准确性和可靠性；
21、(2)本专利技术构建的基于多价框架核酸探针，为针对膜蛋白受体的信号放大传感器，操作简便，便于储存应用。
22、(3)构建的基于多价框架核酸探针，为利用hcr反应构建信号放大的生物传感器，实现了膜蛋白生物标志物的低成本、可视化分析。
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1.一种多价框架核酸探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三的具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤三和四中TM缓冲液的pH为8.0，含5mM Mg2+。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3.2中，超滤操作的条件是截留分子量：100kD，离心力，3000g，离心时间：10min。
6.一种基于权利要求1-5中任意一项所述制备方法制备的多价框架核酸探针。
7.一种基于权利要求6所述多价框架核酸探针的细胞膜蛋白成像分析方法，其特征在于，将构建的多价框架核酸探针加入到待检测细胞的培养基中，培养一段时间后，弃去培养基，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞的成像荧光。
8.根据权利要求7所述的细胞膜蛋白成像分析方法，其特征在于，将构建的多价框架核酸探针加入到待检测细胞的培养基中，置于4℃冰箱，1小时后，弃去培养基，用PBS洗涤三次，之后用激光扫
...【技术特征摘要】
1.一种多价框架核酸探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三的具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤三和四中tm缓冲液的ph为8.0，含5mm mg2+。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3.2中，超滤操作的条件是截留分子量：100kd，离心力，3000g，离心时间：10min。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：朱茗郅，向雯洁，周子怡，何智梅，晁洁，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：
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