【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种洋葱来源外泌体的提取纯化方法以及在皮肤抗炎中的应用，属于生物。
技术介绍
1、早在20世纪六十年代，植物中有细胞外囊泡（ev）的研究就已被报道外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的具有脂质双分子层膜结构的微小囊泡。外泌体的大小：30nm~ 150 nm，大多数类型的细胞都可以分泌外泌体。外泌体在自然界中也广泛存在，包括哺乳动物的血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁等，植物的根茎叶中，外泌体中富含核酸、蛋白、脂质等活性生物分子。外泌体频繁穿梭于细胞之间，为细胞之间的通信提供了桥梁，成为疾病标志物、疾病机理、药物开发等研究的创新热点。外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。
2、自然界中植物广泛存在，中国是世界上最大的洋葱生产国，每年的产量约为2400万吨，占全球洋葱产量的23%左右。中国的洋葱种植面积广阔，各地区均有生产，主要集中在山东、甘肃、河北、江苏、四川等省份。洋葱外泌体具有抗炎、抗氧化和修复的功效，可对皮肤的护理起到较好的功效作用。
3、目前对于动物来源的外泌体的提取方法有很多，也比较成熟，但对于洋葱来源的外泌体的提取方法却比较欠缺，暂无相关的可以大批量提取的方法，由于洋葱细胞的特殊性，具有较厚的细胞壁、富含纤维成分并且果实中含有较多的果胶成分，比较坚硬和粘稠，难以提取纯化外泌体，尚无特别高效的方法进行大批量的提取纯化处理。
技术实现思路
1、本专利技术的洋葱来源外泌体的提取纯化方法以及在皮肤抗炎中
2、其中，利用纤维素酶和果胶酶碱进行处理洋葱的碎块，从而得到比较充分的洋葱的悬浊液，更利于外泌体的释放。利用超滤换液的方法可以去除洋葱外泌体中的一些小分子的杂质，从而得到粗提取的洋葱外泌体的产物。利用离子交换层析的方法进行外泌体粗提取物的进一步纯化，留取流穿液，即为外泌体最终产物，得到较纯外泌体，皮肤抗炎效果较为明显。
3、现有的离心法对于设备的要求比较高，需要比较先进的大型离心机，能够达到较高的离心力，但成本投入较高，难以广泛的应用。peg沉淀法对于试剂的残留的去除较难，容易导致产品里的残留而难以去除，且沉淀的效果较差，不能完全的得到外泌体，损失较大。而密度梯度离心的方法，处理的外泌体的量较小，只能处理小批量的外泌体，用于科研研究用，并不能进行大规模的生产。凝胶过滤层析的上样量比较受限，同样的层析柱体积处理样品体积较小，柱子要求体积较大，容易吸附杂质而导致难以清洁，成本较高，不适合大批量的制备。因此，需要一种既能够大批量的高纯度的提取纯化外泌体，又能够比较节约成本的方法。
4、通过对大量的洋葱的前处理，破碎、酶解，得到洋葱的碎渣，用超滤提取的方法进行粗提取，在进行离子交换层析纯化，进一步的纯化洋葱外泌体，得到较纯的洋葱外泌体，并进行抗炎修复的测试。
5、为实现该目的，本专利技术所采用的技术方案为一种洋葱来源外泌体的提取纯化方法及制备的外泌体和应用，步骤如下：具体而言，本专利技术提供了一种洋葱来源的外泌体，其特征在于，该专利技术中洋葱来源的外泌体是从洋葱中提取纯化而来的，洋葱来源的外泌体为椭圆形或茶杯状形态，并具有碟形、中间凹陷的结构，该囊泡的大小集中在30-200nm之间，平均粒径在100-130nm之间。
6、s1.对洋葱进行处理，切碎后进行研磨，加入缓冲溶液进行冲洗和悬浮混合，形成混浊液，加入纤维素酶和果胶酶进行混合，后在低温下进行晃动混匀处理。
7、s2.过滤去除大颗粒的固体沉淀物，得上清液，对过滤沉淀物再一次清洗，弃沉淀，留上清液，两次上清液合并。
8、s3.将步骤s2得到的上清液进行离心处理，弃沉淀，留上清液。
9、s4.将步骤s3得到的上清液进行两次过滤，第一次进行深层过滤，第二次采用小孔径滤器进行过滤。
10、s5.将步骤s4得到的上清液进行超滤浓缩后洗滤，得到超滤浓缩洗滤后的外泌体粗提取溶液。
11、s6.将步骤s5得到的外泌体粗提取溶液进行离子交换层析，得到纯化的洋葱外泌体。
12、通过利用上述技术方案，由于洋葱鳞片叶的外表皮比较厚肉，采用纤维素酶和果胶酶对洋葱细胞的细胞壁进行水解和处理，控制纤维素酶和果胶酶的浓度可以保证对洋葱细胞壁的的水解，提高酶解的效率，释放洋葱细胞间质中的外泌体，通过过滤等步骤去除细胞组织，获得含洋葱外泌体的粗提取液，很好的降低了外泌体样品的粘稠度，再采用阴离子交换层析色谱柱分离杂质，最终阴离子交换层析色谱柱进行收集流穿液得到外泌体的最终产品，使外泌体的纯度进一步提高。
13、优选地，所述步骤s1中缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、hepes中的一种或多种，缓冲溶液的浓度为10mmol/l~100mmol/l。
14、优选地，所述步骤s1中加入纤维素酶的浓度为0.03%~0.15%之间和果胶酶的浓度为0.05%~0.25%之间，酶解时间为6h~12h之间，酶解的保持温度为10℃~20℃，酶解过程中持续晃动。
15、优选地，所述步骤s2中过滤大颗粒采用孔数为60目~200目的纱布。
16、优选地，所述步骤s3中离心力为5000g~10000g，温度为4℃~10℃，时间为40min~80min。
17、优选地，所述步骤s4中第一次滤器为0.02μm~1.5μm孔径的深层滤器，第二步滤器为pes材质，孔径为0.2μm~0.4μm。
18、优选地，所述步骤s5中进行超滤浓缩换液，通过超滤膜包或者中空纤维柱进行浓缩和洗滤，超滤膜包截留分子量为100kda~1000kda，中空纤维截留分子量为100kda~1000kda。
19、优选地，所述步骤s5中缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、hepes中的一种或多种，缓冲溶液的浓度在10mmol/l~100mmol/l。
20、优选地，所述步骤s6中所述离子交换层析为弱阴离子交换层析或强阴离子交换层析。
21、优选地，所述步骤s6中层析平衡液为磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、hepes中的一种或多种，缓冲溶液的浓度在10mmol/l~100mmol/l。洗脱液为氯化钠溶液，浓度在1mol/l~2mol/l。
22、优选地，为充分去除杂质超滤后进行洗滤的次数为5~10次。
23、优选地，阴离子交换层析的基质为高度交联的琼脂糖微球，配基为季铵盐或羟基磷灰石，填料平均粒径范围为80μm~120μm。
24、优选地，处理洋葱的量为100g~100kg。
25、优选地，外泌体层析后得到的外泌体样品收集为流穿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES中的一种或多种，缓冲液浓度为10mmol/L~100mmol/L。
3.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中纤维素酶浓度为0.03%~0.15%，果胶酶浓度为0.05%~0.25%；酶解时间为6h~12h；酶解的保持温度为10℃~20℃；酶解过程中持续晃动。
4.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中过滤大颗粒采用孔数为60目~200目的纱布。
5.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中离心力为5000g~10000g，温度为4℃~10℃，时间为40min~80min。
6.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S4中第一次滤器为0.02μm~1.5μm孔径的深层滤
7.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S5中采用超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100kDa~1000kDa，中空纤维截留分子量为100kDa~1000kDa，采用磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES中的一种或多种缓冲液进行洗滤，缓冲溶液的浓度为10mmol/L~100mmol/L。
8.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤S6中所述离子交换层析为弱阴离子交换层析或强阴离子交换层析，离子交换层析平衡液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES中的一种或多种，缓冲溶液浓度为10mmol/L~100mmol/L，洗脱液为氯化钠溶液，浓度为1mol/L~2mol/L。
9.如权利要求1～8任意一项所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法制备的外泌体。
10.如权利要求9所述的外泌体在皮肤抗炎修复中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、hepes中的一种或多种，缓冲液浓度为10mmol/l~100mmol/l。
3.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤s1中纤维素酶浓度为0.03%~0.15%，果胶酶浓度为0.05%~0.25%；酶解时间为6h~12h；酶解的保持温度为10℃~20℃；酶解过程中持续晃动。
4.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤s2中过滤大颗粒采用孔数为60目~200目的纱布。
5.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤s3中离心力为5000g~10000g，温度为4℃~10℃，时间为40min~80min。
6.如权利要求1所述的洋葱来源外泌体的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤s4中第一次滤器为0.02μm~1.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴光彦，赵刚刚，
申请(专利权)人：北京利和制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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