具有抗炎作用的抗体靶向补体抑制物制造技术

本发明专利技术公开了抗Ｐ选择素单链抗体靶向补体抑制物ＳｃＦｖ－ＣＤ５９及其应用。其目的是提供一种具有特异靶向性的抗Ｐ选择素单链抗体靶向补体抑制物ＳｃＦｖ－ＣＤ５９及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。抗Ｐ选择素单链抗体靶向补体抑制物ＳｃＦｖ－ＣＤ５９是通过连接肽在抗Ｐ选择素单链抗体ＳｃＦｖ的氨基端连接补体抑制物ＣＤ５９得到的融合蛋白。实验证明，ＳｃＦｖ－ＣＤ５９能显著提高抑制补体介导的细胞裂解效，并可在免疫损害部位高度聚集，能够明显抑制炎症的发生发展，而且显著降低补体抑制物造成感染的副作用。因而可以其为活性成分制备成针对治疗炎症反应的靶向Ｐ选择素补体抑制物新型基因工程靶向蛋白药物。本发明专利技术将在医药学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因产品领域，特别是涉及一种具有特异靶向性的抗P选择素单链抗体耙向补体抑制物ScFv-CD59及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。
技术介绍
炎症是人类疾病中最常见的而复杂病例过程，可以发生于机体的任何部位和任何 组织。在多种疾病如肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病及创伤后等均有 不同程度的炎症反应。最近的研究发现，当炎症的程度严重或发展成慢性炎症时，它 也能导致多种疾病的发生。预防和治疗炎症及相关综合症始终是医学领域的棘手问 题。各种炎症虽然有其特殊性，但从局部的病理变化看来，它们都有很多共同点，即 都是机体对致炎因子的损伤作用所产生的一种过激反应。目前，大量的资料表明炎症 的发生与P选择素的高表达和补体的激活密切相关。炎症反应始于炎症细胞黏附、迁移、浸润、活化以及炎症因子释放。在循环中白 细胞募集到反应组织是炎性反应的基础，白细胞与内皮细胞的粘附是炎症的起始步 骤。白细胞与内皮细胞的接触、黏附以及在血管壁上的滚动主要由选择素介导。P选 择素介导活化的血小板和单核细胞及中性粒细胞的连接，皮细胞与中性粒细胞的快速 黏附亦主要依靠P选择素介导。P选择素糖蛋白配体-1(PSGL-l)是P选择素的高亲和力 配体，表达于所有的血中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。P选择素与PSGL-l结合后， 调节细胞因子的分泌，参与炎症反应。如活化血小板与单核细胞上的PSGL-l结合，可 诱导单核细胞超氧阴离子释放，组织因子的表达，增加血小板活化因子合成和吞噬作 用。此外，还可以诱导单核细胞趋化因子-l(MCP-l)、 TNF-a、白介素等的合成。P选择素主要分布于静息血小板的a颗粒和内皮细胞的Weibel palade小体中。正 常情况下P选择素不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后，血小板的a颗粒 和内皮细胞Weibel-Palade小体迅速与质膜融合而使P选择素在血小板和内皮细胞的 表面显著表达，且原先不表达的组织也出现表达。资料表明P选择素参与了多种疾病 的病理生理过程，其过度或持续表达已成为某些组织病变的标志。已有研究表明抗P 选择素抗体、纯化游离P选择素、抗sLeX可抑制活化的血小板和单核细胞及中性粒细 胞的连接，从而抑制炎症反应产生。因此，抑制P选择素表达及其细胞黏附作用可为 疾病的诊断和治疗提供了新的策略。补体既是生理性防御物质，又是造成病理性损伤的介质。补体系统能促进吞噬和 溶解靶细胞，是机体免疫防御机制的重要组成部分，对消除外来抗原的侵害，维护机 体内环境的平衡具有重要作用，但另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系 统活化又可产生炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞损伤。补 体激活过程中产生不同的蛋白水解片段，从而介导各种生物学效应调节作用、引起炎症反应。另外，补体在细胞表面激活，由C5b-9组成MAC。 MAC为大分子复合物，它形 成跨膜孑L道，使大分子物质和离子双向流动，导致细胞溶解；MAC还能促进释放细胞 因子、氧自由基和金属基质蛋白，加剧炎性反应。目前已证明，在肿瘤、心脑血管疾 病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相关的如关节炎、早老性痴呆病、骨质疏松 症等多种的疾病的炎症反应均与补体的激活有关。CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固型糖蛋白，分子量约18-20kD。由 103个aa组成，含单一的N端糖化位点，其C端籍GPI与细胞锚连。CD59具有多种重要的 免疫功能，是一种重要的补体调节蛋白，也是CRPs唯一作用于补体激活最后阶段的抑 制性蛋白。主要通过抑制C9与C5b-8结合或C9分子的延伸，阻断补体的激活,抑制MAC的 形成。在有CD59存在的情况下，在同种或自身细胞的表面不能顺利地完成MAC的全部 组装，或不能组装成C5b-9复合物，从而限制了对同种或自身细胞的溶解作用，减轻 了炎症反应。试验证明突变的CD59分子失去了抗补体活性，不能抑制MAC形成，致使MAC 大量沉积于血管内皮，引起严重的炎症反应。因此，CD59作为体抑制剂可以减轻炎症 反应所致的病理学改变，作为潜在的抗炎因子保证自身免疫和炎症性疾病的治疗作 用。目前，多种补体抑制物正在研制中，如美国已有CRl和C5a的单克隆抗体进入二、 三期临床。另外。抗MBLmAb，抗C5 mAb和抗C9 mAb、眼镜蛇毒因子、N-乙酰肝素、 蛋白抑制剂FUT-175等也有一定的抗补体作用。但这类系统性补体抑制物虽然改善了 炎症反应，由于补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，同时全身性的补体抑 制，也会造成感染等潜在的副作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种具有抗炎作用的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物 ScFv-CD59。本专利技术所提供的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59，是通过连接肽 在抗P选择素单链抗体ScFv的氨基端(N端)连接补体抑制物CD59得到的融合蛋白。具体来讲，所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59，是下述氨基酸 残基序列之一1) 序列表中的SEQ ID NO: 1;2) 将序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO: 1由323个氨基酸残基组成，自氨基端第251-323位氨 基酸残基为补体抑制物CD59,自氨基端第241-250位^^^^^t肽(Gly4Ser) 2，自 氨基端第卜240位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自氨基端第1-122 位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自氨基端第133-240位氨 基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。编码上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59的基因，是下述核苷酸 序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；2) 编码序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；3) 与序列表中SEQ ID NO: 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗炎 作用的核苷酸序列；4) 在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。所述高严谨条件为杂交后用含0. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液在 65t:下洗膜。序列表中的SEQ IDNO: 2由969个碱基组成，其编码序列为自5'端第1-969位 碱基，编码具有序列表中SEQIDNO:l的氨基酸残基序列的蛋白质，自5'端第751-969 位碱基编码补体抑制物CD59 (1-72aa)，自5'端第721-750位i^^^H太(Gly^Ser) 2，自5'端第1-720位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自5'端第1-366 位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自5'端第397-720位碱基编码 抗P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。含有本专利技术抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59基因的表达载体、转 基因细胞系和宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59编码基因中任一片段的引物 对也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还提供了用于表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗Ｐ选择素单链抗体靶向补体抑制物ＳｃＦｖ－ＣＤ５９，是通过连接肽在抗Ｐ选择素单链抗体ＳｃＦｖ的氨基端连接补体抑制物ＣＤ５９得到的融合蛋白。

【技术特征摘要】
1、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59，是通过连接肽在抗P选择素单链抗体ScFv的氨基端连接补体抑制物CD59得到的融合蛋白。2、 根据权利要求l所述的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59，其特 征在于所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59，是下述氨基酸残基序 列之一1) 序列表中的SEQ ID NO: 1;2) 将序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。3、 编码权利要求1或2所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59的 基因。4、 根据权利要求3所述编码抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CD59的 基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；2) 编码序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列;3) 与序列表中SEQ ID NO: 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗炎 作用的核苷酸序列；4) 在高严谨条件下可与序列表中...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宏彬，张传福，贾雷立，周育森，徐元勇，王勇，刘雪林，靳连群，孙岩松，黄留玉，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]