【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病源性微生物检测，具体为一种识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme及其应用。
技术介绍
1、近年来，由于人类对海洋资源的不断开发，导致海洋环境变得复杂，各种海洋微生物大量繁殖，尤其是海洋致病菌，因其数量庞大且分布范围较广，造成水生动物感染及水环境污染事件频发，水产动物大面积死亡，给水产养殖业造成巨大的经济损失。水产品的质量无法得到保障。被感染的水产品通过食物链进入到人体，极易引起食物中毒，其中弧菌病是影响多种水产养殖动物尤其是海水养殖鱼类、贝类和甲壳类最常见的细菌性疾病之一。
2、哈维氏弧菌是一种弯曲杆状、嗜盐的革兰氏阴性菌，广泛分布在海洋、河口水生生态系统中，是一种感染海水鱼类、贝类和甲壳类的主要致病菌。随着中国水产养殖品种的增多，该病原菌感染的宿主范围也在逐渐扩大。鱼类感染后一般会出现鳞片脱落和肌肉坏死、血管炎、感染性坏死性肠炎、眼部病变等症状，还会导致虾类出现对虾烂鳃病、红体病、发光弧菌病及贝类的皱纹盘鲍脓疱病、肌肉萎缩症，方斑东风螺肿吻症等，其流行面积广，死亡率较高，给水产养殖业造成巨大经济损失。同时，哈维氏弧菌也是一种新兴的食源性病原体，感染后致使人类患有急性肠胃炎、感染伤口发炎，甚至会导致皮下组织和肌肉坏死。对水产品质量安全以及人类健康造成严重威胁。目前对哈维氏弧菌的治疗尚无有效手段，主要依赖于抗生素，因此哈维氏弧菌的早期检测对于预防和控制尤为重要。国内外对哈维氏弧菌的检测方法有很多：传统的微生物培养法步骤繁琐、检测周期长。
3、脱氧核酶(deoxyribozymes，dnazy
4、在2020年，keerthana setlem报道了基于双适配-dnazyme的比色法用于检测复杂样品中的afb1。该实验用dnazyme连接适配体检测apta磁珠捕获的afb1，具有较高的稳定性和特异性。基于此，本专利技术设计了一种双dnazyme生物传感器用于检测哈维氏弧菌。该方法利用selex技术筛选出能特异性识别哈维氏弧菌的dnazyme，优化其反应条件，并应用所获得特异性高、灵敏度好的dnazyme来制备生物传感器，为水产致病菌哈维氏弧菌的检测提供简单、快速的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme及其应用，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme及其应用，包括dvh1、dvh3两条dnazyme脱氧核糖核苷酸序列：
3、所述dvh1为:5’-gcccccgtaatgtcatgtagccgcaggcgccatcatg ttgcaccctaagggattgcatctgtagcgtagtgtcg-3’；
4、所述dvh3为:5’-gcccccgtaatgtcaaggtcccgcaggggctttcacttcgtccctgtatgtttcgcatctgtagcgtagtgtcg-3’。
5、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述dnazyme序列的在3’端上有标记淬灭集团。
6、一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme的筛选方法，其特征在于：采用磁珠selex法筛选dnazyme；
7、具体步骤如下：
8、步骤1：实验所用的文库和引物由自己设计并于上海生工合成；
9、步骤2：将用于实验过程的哈维氏弧菌及其他反筛菌在lb液体培养基中进行培养，检测菌悬液的od值；
10、步骤3：将步骤2所得菌悬液分装于1.5ml无菌ep管离心，保留上清液(胞外产物)，-20℃储存备用；
11、步骤4：将中心区域含有40个随机碱基和两端分别有20个固定碱基数的初始文库与引物通过pcr反应进行连接，引入ra切割位点和生物素标签，切胶回收dna；
12、步骤5：将步骤4所得pcr产物和链霉亲和素包被的磁珠在30℃下连接30min；
13、步骤6：连接结束后磁性分离弃去上清，磁珠用亲和素反应缓冲液清洗三次；
14、步骤7：用0.2m的naoh洗涤磁珠两次，磁性分离以制备单链；
15、步骤8：超纯水清洗磁珠3次，使ph值接近于中性；
16、步骤9：将等体积的哈维氏弧菌胞外产物与2×筛选缓冲液混合，30℃孵育1h，发生切割反应，磁性分离，醇沉法回收上清液；
17、步骤10：以步骤9所得产物为模板，加入带有生物素的引物进行pcr扩增，用于下一轮筛选；
18、步骤11：将第九轮所得的pcr产物高通量测序并进行dna序列分析；
19、步骤12：候选dnazyme活性及性质检测；
20、步骤13：准备洁净的96孔板板盖，用海藻糖及普鲁兰多糖固定dnazyme复合物。
21、作为本专利技术的一种优选技术方案，在dna序列的5’端标记生物素；
22、步骤2中所使用的哈维氏弧菌的od600＝1.0；
23、dna与磁珠结合，切割反应，醇沉回收均在1.5ml无菌ep管中进行；
24、使用超微量紫外分光光度计(q5000，美国)检测dna浓度。
25、作为本专利技术的一种优选技术方案，使用全波长多功能微孔板检测仪(m1000pro，瑞士)检测dnazyme切割荧光强度。
26、作为本专利技术的一种优选技术方案，dnazyme筛选过程中使用的磁珠直径为0.5μm。
27、一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme体系在水产品检测中的应用。
28、一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme在制备能够快速检测哈维氏弧菌的生物传感器中的应用。
29、一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的试剂盒，所述试剂盒含有双dnazyme。
30、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme，其特征在于：包括DVh1、DVh3两条DNAzyme脱氧核糖核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme，其特征在于：所述DNAzyme序列的在3’端上有标记淬灭集团。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme的筛选方法，其特征在于：采用磁珠SELEX法筛选DNAzyme。
4.根据权利要求3所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme的筛选方法，其特征在于：在DNA序列的5’端标记生物素；
6.根据权利要求4所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme的筛选方法，其特征在于：使用全波长多功能微孔板检测仪检测DNAzyme切割荧光强度。
7.根据权利要求4所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme的筛选方法，其特征在于：DNAzyme筛选过
8.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme体系在水产品检测中的应用。
9.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双DNAzyme在制备能够快速检测哈维氏弧菌的生物传感器中的应用。
10.一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-2任一项所述的双DNAzyme。
...【技术特征摘要】
1.一种能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme，其特征在于：包括dvh1、dvh3两条dnazyme脱氧核糖核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme，其特征在于：所述dnazyme序列的在3’端上有标记淬灭集团。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme的筛选方法，其特征在于：采用磁珠selex法筛选dnazyme。
4.根据权利要求3所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述的能特异性识别、检测哈维氏弧菌的双dnazyme的筛选方法，其特征在于：在dna序列的5’端标记生物素；
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【专利技术属性】
技术研发人员：王淑军，李思盈，张帅，吕明生，章均哲，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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