【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶促dna合成领域，具体涉及末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)的及其功能性片段的突变体。更特别地，本专利技术涉及适用于掺入修饰的核苷酸的突变体，用于合成具有确定的或可控序列的核酸分子。
技术介绍
1、相比传统的化学合成方法，酶促dna合成的聚合方式和反应条件更为温和，可以在水溶液中工作，能有效减少合成过程中发生的dna损伤和副反应，不会产生危险的废物，并且具有持续合成更长的寡核苷酸片段的潜力，有望将dna的合成成本降低2～3个数量级。因此，酶促dna合成由于其具有更加绿色环保，且在合成速度、长度、效率及成本等方面拥有化学合成无法比拟的潜力。
2、末端脱氧核苷酸转移酶属于聚合酶x家族，是在哺乳动物中发现的第一批dna聚合酶之一。其最令人瞩目的性质是可以在不需要模板链的情况下，以至少三个核苷酸长度的寡核苷酸链为引物合成寡核苷酸链，且偶联效率高，持续合成能力强。据报道，末端脱氧核苷酸转移酶在1s内可以添加多个核苷酸，延伸单链dna可产生长达8000nt的均聚物，在合成速度和合成长度上具有远超商业亚磷酰胺合成技术的潜力，因此tdt成为了dna酶促合成的理想候选酶。
3、作为酶促dna合成使用的底物，带有可逆修饰基团的脱氧核苷三磷酸(rt-dntp)相较于天然核苷三磷酸(dntp)具有更大的体积，当它们进入天然的tdt酶的催化口袋时，会受到空间位阻的影响而不易掺入，修饰基团也可能使rt-dntp在酶中的构象改变，从而降低了催化效率，这成为了基于tdt的酶促dna合成走向实际应用的最大瓶颈。因此，大多研究者
4、虽然在多家企业及科研机构的努力下，酶促dna合成已经在正确率上开始超越传统的化学合成方法，但要要想进一步提高酶促dna合成的速度和合成片段长度，除了需要优化合成操作步骤外，该技术的关键工具末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)的表达水平、热稳定性和催化带阻断基团底物的活力成为了主要技术瓶颈。目前所公开的末端脱氧核苷酸转移酶及其变体并不完全令人满意，特别是它们的异源表达水平差、热稳定性差和低活性。
技术实现思路
1、本专利技术提供了具有优异的表达量、强大的热稳定性和高效的催化效率的末端脱氧核苷酸转移酶及其功能化突变体。本专利技术公开了来源于湾鳄(crocodylus porosus)的末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)以及其功能性片段突变体，并用于合成糖环3’位修饰的寡核苷酸。
2、本专利技术一方面提供了一种多肽，所述多肽：
3、(a)具有seq id no.1所示的序列或与其有至少75％序列相同性的序列，
4、(b)是seq id no.1的具有第n-375位氨基酸的片段，其中n是21-148的正整数，或是与所述片段有至少75％序列相同性的多肽，或
5、(c)是(a)或(b)的具有突变的变体，所述突变是选自以下任意一个或多个位点的突变：g192、g193、r196、k198、g201、h202、v253、d254、l256、g313、g316、r318、r325和n338，或是与所述变体有至少75％序列相同性并且保留所述突变的多肽，
6、(d)将(a)或(b)或(c)添加标签序列、信号序列或分泌信号序列后形成的、并具有末端脱氧核苷酸转移酶活性的多肽。突变的氨基酸编号参考seq id no:1。
7、在一个或多个实施方案中，n是21、41、61、81、101、121、128、141或148。即(b)是seqid no.1的n端去除20、40、60、80、100、120、127、140或147个氨基酸的片段。
8、在一个或多个实施方案中，(b)如seq id no:2所示。
9、在一个或多个实施方案中，(c)是seq id no:2的具有所述突变的变体。
10、在一个或多个实施方案中，所述突变选自以下任一组或多组：
11、(1)l256t、l256s、l256r、l256q、l256p、l256n、l256i、l256w、l256e、l256m、l256k、l256h、l256g、l256f、l256d、l256c、l256a中的任一个，
12、(2)r318a、r318d、r318v、r318n、r318f、r318q、r318w、r318i、r318e、r318g、r318c、r318h、r318t、r318k、r318l、r318m、r318p、r318s、r318y中的任一个，
13、(3)k198a、k198c、k198d、k198e、k198f、k198g、k198h、k198i、k198l、k198m、k198p、k198q、k198r、k198s、k198t、k198v、k198w、k198y、k198n中的任一个，
14、(4)v253a、v253d、v253e、v253f、v253g、v253h、v253i、v253k、v253m、v253n、v253q、v253r、v253s、v253t、v253w、v253y、v253p、v253c、v253l中的任一个，
15、(5)g192a或g192h，(6)g193a，(7)d254a,(8)g201a，(9)h202a，(10)g313a，(11)g316a，(12)r325a和(13)r196c、r196d、r196e、r196g、r196h、r196i、r196k、r196l、r196m、r196n、r196s、r196q、r196v、r196w、r196y、r196p、r196f、r196t中的任一个。
16、本专利技术另一方面提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸的序列包括选自以下的一种或多种：
17、(a)编码本文所述多肽的核苷酸序列或其互补序列，
18、(b)与(a)所示序列有至少80％(较佳地至少90％)相同性的核苷酸序列，和
19、(c)(a)或(b)的互补序列。
20、本专利技术另一方面提供了一种核酸构建物，该核酸构建物包含本文所述的多核苷酸。
21、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。优选地，所述核酸构建物是表达载体或同源重组载体。
22、在一个或多个实施方案中，所述载体是重组表达质粒，可用于本专利技术所述末端脱氧核苷酸转移酶及其功本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽，所述多肽：
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，n是21、41、61、81、101、121、128、141或148。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突变选自以下任一组或多组：
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突变选自以下任一组：
5.分离的多核苷酸，所述多核苷酸的序列包括选自以下的一种或多种：
6.一种核酸构建物，该核酸构建物包含权利要求5所述的多核苷酸，
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
8.权利要求1-4中任一项所述的多肽的制备方法，包括步骤：在适合表达所述多肽的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞。
9.权利要求1所述的多肽在催化末端脱氧核苷酸转移反应或合成DNA中的用途，
10.一种催化末端脱氧核苷酸转移反应或合成DNA的方法，包括步骤：在权利要求1-4中任一项所述的多肽存在下，使脱氧核苷酸与寡脱氧核苷酸链接触，所述寡脱氧核苷酸链长度为至少3个核苷酸，
【技术特征摘要】
1.一种多肽，所述多肽：
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，n是21、41、61、81、101、121、128、141或148。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突变选自以下任一组或多组：
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突变选自以下任一组：
5.分离的多核苷酸，所述多核苷酸的序列包括选自以下的一种或多种：
6.一种核酸构建物，该核酸构建物包含权利要求5所述的多核苷酸...
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