【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于等温条件下鉴别诊断羊吕氏泰勒虫的试剂盒及可视化检测方法。
技术介绍
1、羊泰勒虫属于泰勒科泰勒属的蜱传型血液原虫，通常大量寄生于绵羊和山羊淋巴细胞、巨噬细胞或红细胞内，进而引发血液原虫病。感染后的羊会发育不良甚至死亡，严重影响了畜牧业的发展。目前公认感染羊的泰勒虫有6种，分别是绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、莱氏泰勒虫、分离泰勒虫、隐藏泰勒虫。目前我国报道的羊泰勒虫主要有绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫。吕氏泰勒虫是能被青海血蜱传播但不能被小亚璃眼蜱传播的一个新种，长角血蜱也是吕氏泰勒虫的有效传播媒介，吕氏泰勒虫具有较强的感染力和致病力，且在我国分布广泛，极大的阻碍了我国养殖业的发展。
2、目前，羊泰勒虫病实验室诊断的方法主要有病原形态观察、血清学检测及pcr检测。血涂片或淋巴结涂片染色法是最传统的实验室诊断方法，该方法简便、廉价，但是依赖于检测人员的寄生虫形态学经验，当染虫率较低或隐性感染时存在漏检，该方法的准确性有待验证，且上述方法忽略了载体动物，干扰信号从成像焦平面以外进入而使画面分辨率降低，而且由于不同种泰勒虫在形态上具有相似性而难以区别。
3、随着检测技术的不断更新，羊泰勒虫病的检测方法也有了迅速的发展。目前，羊泰勒虫病实验室诊断的方法主要有病原形态观察、血清学检测及pcr检测。血涂片或淋巴结涂片染色法是最传统的实验室诊断方法，该方法简便、廉价，但是依赖于检测人员的寄生虫形态学经验，当染虫率较低或隐性感染时存在漏检，该方法的准确性有待验证。间接免疫荧光试
4、环介导等温扩增(lamp)技术在等温条件下以高特异性、高效率快速地扩增目的dna，该方法使用一种dna聚合酶和一组4-6条特殊设计的引物，可以特异性识别目的dna上的6个区域，反应只需要把基因模板、引物、链置换型dna聚合酶等共同置于一定温度下(60-68℃)，经一个步骤即可完成，扩增效率极高，可在30-60min内实现109-1010倍的扩增。纳米生物传感条(lfb)因其低成本、快速、简单而被广泛用作分析lamp产物的替代工具。
5、本专利技术根据吕氏泰勒虫核糖体大亚基rna(28s rrna)基因序列设计了几组特异性引物，建立一种检测吕氏泰勒虫的lamp-lfb方法，该lamp-lfb检测方法特异性高、灵敏性高，能准确、快速的检测吕氏泰勒虫。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的是提供一种用于检测吕氏泰勒虫的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如seq id no.25所示。
2、本专利技术的第二目的是提供一种用于检测吕氏泰勒虫lamp引物组，所述lamp引物组包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物、lf引物和lb引物；所述fip引物的核苷酸序列如seqid no.5所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述lf引物的核苷酸序列如seq id no.23所示，所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.24所示。
3、本专利技术的第三目的是提供一种用于检测吕氏泰勒虫的的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的lamp引物组，所述fip引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述lf引物的5′端标记生物素。
4、优选的，所述试剂盒建立了lamp反应体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，mgso4的浓度为2～12mmol/l，dntp mix的浓度为0.6～2.2mmol/l，反应温度设置为60～66℃，反应时间设置20～70min。
5、优选的，所述的lamp反应体系：内外引物浓度比例为6:1，mgso4的浓度为6mmol/l，dntpmix的浓度为1.4mmol/l，反应温度设置为63℃，反应时间设置40min。
6、本专利技术的第四目的是提供利用所述的试剂盒在非诊断目的的检测吕氏泰勒虫中的应用。
7、本专利技术的第五目的是提供一种吕氏泰勒虫的lamp可视化检测方法，包括以下步骤：
8、(1)提取待测样品的dna；
9、(2)将步骤(1)提取得到的dna，加入权利要求3-5任一项所述试剂盒中进行反应；
10、(3)对反应结果进行判定：当dna扩增产物中存在如seq id no.25所示靶序列时，t线、c线均显色，判定为阳性；只有c线显色，标记为阴性；t线、c线均不显色，判定为无效。
11、本专利技术的第六目的是提供利用所述的lamp引物组在非诊断目的的检测吕氏泰勒虫中的应用。
12、本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了用于检测吕氏泰勒虫的靶序列和对应靶序列的lamp引物，并筛选建立了lamp体系，使用所述的lamp引物组和lamp体系制备了用于检测尤氏泰勒虫的试剂盒，所述的试剂盒在检测吕氏泰勒虫时，具有特异性高、敏感性高以及临床可行性强的特点，且操作简单，不需要复杂的仪器，检测成本低。
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1.一种用于检测吕氏泰勒虫的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如SEQID NO.25所示。
2.一种用于检测吕氏泰勒虫LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物和LB引物；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述F3引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述LF引物的核苷酸序列如SEQID NO.23所示，所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
3.一种用于检测吕氏泰勒虫的的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2所述的LAMP引物组，所述FIP引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述LF引物的5′端标记生物素。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒建立了LAMP反应体系：内外引物浓度比例为2:1～12:1，MgSO4的浓度为2～12mmol/L，dNTP Mix的浓度为0.6～2.2mmol/L，反应温度
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应体系：内外引物浓度比例为6:1，MgSO4的浓度为6mmol/L，dNTP Mix的浓度为1.4mmol/L，反应温度设置为63℃，反应时间设置40min。
6.利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒非诊断目的的在检测吕氏泰勒虫中的应用。
7.一种吕氏泰勒虫的LAMP可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.利用权利要求2所述的LAMP引物组在非诊断目的的检测吕氏泰勒虫中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测吕氏泰勒虫的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如seqid no.25所示。
2.一种用于检测吕氏泰勒虫lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物、lf引物和lb引物；所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述f3引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述lf引物的核苷酸序列如seqid no.23所示，所述lb引物的核苷酸序列如seq id no.24所示。
3.一种用于检测吕氏泰勒虫的的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求2所述的lamp引物组，所述fip引物的5′端标记异硫氰酸荧光素，所述lf引物的5′端标记生物素。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵帅阳，朱浩瀚，关贵全，刘军龙，张少华，罗建勋，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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