【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学，具体涉及一种分离、测定左亚叶酸钙中间体z2及其有关杂质的方法。
技术介绍
1、左亚叶酸钙中间体z2是左亚叶酸钙合成过程中的关键中间体，其中文化学名为(6ar)-3-氨基-8-[4-[[(2s)-1,3-二羧基丙基]氨甲酰基]苯基]-1-氧代-2,5,6,6a,7,8-八氢-1h-咪唑并[1,5-f]蝶啶-10-氯化物，分子式为c20h22cln7o6；分子量为528.35；结构式如式ⅰ所示。
2、
3、研究证实，左亚叶酸钙中间体z2中可能存在杂质z1、杂质a、杂质z2b、左亚叶酸钙等杂质，左亚叶酸钙的结构式如式ⅱ所示，杂质z1的结构式如式ⅲ所示，杂质a的结构式如式ⅳ所示，杂质z2b的结构式如式ⅴ所示。
4、
5、杂质a为药典杂质，在各个反应步骤中均进行控制，考察其在各步反应中的消除情况。杂质z2b具警示结构芳胺，为基毒杂质。在中间体z1合成z2反应过程中，z1中的杂质z1b(具警示结构芳胺，其结构式如式vi所示)与甲酸生成的副产物为杂质z2b，属于工艺杂质；并且z2水解也产生杂质z2b。因为杂质z1b在中间体z1中存在水平较高(控制限度为不得过0.2％)，加上本步反应中z2水解产生z2b，所以有必要追踪其后续副产物z2b的生成情况并进行质量控制(控制限度为不得过0.5％)，杂质z2b在成品最终生成杂质e(ep药典法定杂质，控制限度为不得过0.3％)。
6、
7、部分现有技术公开了左亚叶酸钙或其中间体中相关物质的分析方法，如cn1143
8、因此，亟需寻找一种新的方法，来实现左亚叶酸钙中间体z2中杂质z1、杂质a、杂质z2b、左亚叶酸钙的分离和检测，这对左亚叶酸钙药物的质量控制具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种hplc法分离左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的方法，该方法可在大于50分钟的时间或50分钟内实现左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的有效分离，为后续左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的定性和定量提供支持。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、hplc法分离左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的方法，所述杂质包括杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中的任一种或多种；所述hplc法的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括流动相a和流动性b，所述流动相a为磷酸盐缓冲液，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱依次将杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2和/或左亚叶酸钙进行分离；
4、所述左亚叶酸钙中间体z2的结构式如式ⅰ所示，所述左亚叶酸钙的结构式如式ⅱ所示，所述杂质z1的结构式如式ⅲ所示，所述杂质a的结构式如式ⅳ所示，所述杂质z2b的结构式如式ⅴ所示；
5、
6、进一步，各组分被洗脱的顺序依次为：杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2、左亚叶酸钙。
7、进一步，所述梯度洗脱的程序如下：
8、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2；
9、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2；
10、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85-95:15-5；
11、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85-95:15-5；
12、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为80-90:20-10；
13、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2；
14、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为92-98:8-2。
15、优选地，所述梯度洗脱的程序如下：
16、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
17、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
18、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
19、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
20、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85:15；
21、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
22、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5。
23、最优选地，所述梯度洗脱的程序如下：
24、0分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5；
25、8分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5；
26、20分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
27、38分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为90:10；
28、42分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为85:15；
29、42.1分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5；
30、50分钟，设置所述流动相a和所述流动性b的体积比为95:5。
31、进一步，所述流动相a的浓度为0.01-0.03mol/l，ph为3.0-3.5；优选地，所述流动相a的浓度为0.02mol/l，ph为3.2-3.4；ph最优选为3.3。
32、进一步，所述流动性的流速为1.4-1.6ml/min，优选为1.5ml/min；色谱柱的柱温为43-47℃，优选为45℃。
33、优选地，进样体积为20μl。
34、优选地，色谱柱优选agilent zorbax sb-c18，规格为4.6mm×250mm，5μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.HPLC法分离左亚叶酸钙中间体Z2及其杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括杂质A、杂质Z1、杂质Z2b、左亚叶酸钙中的任一种或多种；所述HPLC法的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括流动相A和流动性B，所述流动相A为磷酸盐缓冲液，所述流动相B为甲醇；通过梯度洗脱依次将杂质A、杂质Z1、杂质Z2b、左亚叶酸钙中间体Z2和/或左亚叶酸钙进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A的浓度为0.01-0.03mol/L，pH为3.0-3.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动性的流速为1.4-1.6ml/min，色谱柱的柱温为43-47℃。
5.鉴定左亚叶酸钙中间体Z2中杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括所述杂质A、所述杂质Z1、所述杂质Z2b中的任一种或多种；所述方法包括：采用权利要求1-4任一项所述的方法对左亚叶酸钙中间体Z2及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；将检测品的色谱图和已知对照品的色谱
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测器的检测波长为300±10nm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以左亚叶酸钙中间体Z2为参照峰，相对保留时间为0.34±0.02，判定为杂质A；相对保留时间为0.67±0.02，判定为杂质Z1；相对保留时间为0.88±0.02，判定为杂质Z2b。
8.测定左亚叶酸钙中间体Z2中杂质含量的方法，其特征在于，所述杂质包括所述杂质A、所述杂质Z1、所述杂质Z2b中的任一种或多种；所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用乙腈、水、巯基乙醇的组合作为样品配制溶剂，所述溶剂中，乙腈、水和巯基乙醇的体积比为90-110:890-910:8-12。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用如下色谱条件进行测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相A为浓度为0.02mol/L、pH为3.2-3.4的磷酸盐缓冲液，流动相B为甲醇；流速为1.4-1.6ml/min，柱温为43-47℃；检测波长为300nm；采用如下梯度洗脱程序进行洗脱并得到色谱图：0分钟，设置所述流动相A和所述流动性B的体积比为94.5-95.5：5.5-4.5；
...【技术特征摘要】
1.hplc法分离左亚叶酸钙中间体z2及其杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中的任一种或多种；所述hplc法的色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相包括流动相a和流动性b，所述流动相a为磷酸盐缓冲液，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱依次将杂质a、杂质z1、杂质z2b、左亚叶酸钙中间体z2和/或左亚叶酸钙进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相a的浓度为0.01-0.03mol/l，ph为3.0-3.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动性的流速为1.4-1.6ml/min，色谱柱的柱温为43-47℃。
5.鉴定左亚叶酸钙中间体z2中杂质的方法，其特征在于，所述杂质包括所述杂质a、所述杂质z1、所述杂质z2b中的任一种或多种；所述方法包括：采用权利要求1-4任一项所述的方法对左亚叶酸钙中间体z2及其杂质进行分离；进入检测器进行检测，得到色谱图；将检测品的色谱图和已知对照品的色谱图进行对比，判断检测品中是否含有所述杂质a、杂质z1、杂质z2b中的任一种或多种。
6.根据权利要求5...
【专利技术属性】
技术研发人员：余智奎，陈雯，周书荣，刘阔，
申请(专利权)人：重庆华邦制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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