【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种重组家蚕核型多角体病毒(recombinantbombyx mori nuclear polyhedrosis virus，rbmnpv)的制备方法、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus,raav)制备系统和制备方法。
技术介绍
1、基因治疗(gene therapy，gt)是通过被转导的治疗性遗传物质，如基因、基因片段、rna、基因剪刀等，经转录或/和翻译来治疗疾病的新型疗法，适应症包括遗传性疾病、肿瘤和慢性病等。目前，基于病毒递送治疗性遗传物质的方案占基因治疗总数近90％，而基于raav的上千种临床试验占基因治疗的40％以上。迄今，已经有多款raav病毒载体基因治疗产品获批上市，然而这些产品的生产成本较高。
2、与hek293t细胞/三质粒转染制备系统相比，基于杆状病毒的raav生产系统具有可扩展性、低成本及可预测的生物安全性等优势，更适用于基因治疗药物生产。目前，昆虫细胞/杆状病毒raav制备系统主要基于商业化的bac-to-bac苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(acmnpv)表达系统或其改进版本，包括三杆状病毒系统、两杆状病毒系统、依赖包装细胞系的一杆状病毒系统、不依赖包装细胞系的基于穿梭载体的一杆状病毒系统(onebac system)。虽然前期授权公开号为cn 109609552 b的专利技术专利“重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒”、授权公开号为cn 112553257 b的专利技术专利“一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆
3、然而，若要以极低成本的家蚕蛹为原料开展raav基因治疗制剂的制备，首先基于家蚕杆状病毒表达系统(bmnpv)在细胞水平生产出具有感染活性的raav是关键。bmnpv表达系统是类似于苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(acmnpv)表达系统的又一杆状病毒系统。当前基于该系统已有数百种重组蛋白被表达，包括小鼠白细胞介素3(il-3)、蹄疫亚单位疫苗、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hgm-csf)、乙型肝炎表面抗原(hbsag)疫苗等，但在raav载体生产方面却比较滞后。目前的三家蚕杆状病毒(鲁念等,2018,生物技术进展,第8卷(第1期))、两家蚕杆状病毒系统可生产raav2或者其嵌合病毒(qian等,2021,viruses，2021.13.704.)，但raav载体的产量、满/空衣壳比例及感染效率等均不尽人意，无法满足基因治疗药物的生产需求。公开号为cn 112961219a的专利技术专利“重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用”利用家蚕状病毒表达系统成功制备出具有感染活性的raav，但涉及的单一重组家蚕核型多角体病毒(rbmnpv)是通过在家蚕细胞中重组的方式获得，需要执行耗时耗力的空斑筛选对rbmnpv进行纯化，而且该方法制备的raav也存在上述产量、满/空衣壳比例、感染效率等方面的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的以上缺陷，本专利技术提供一种重组家蚕核型多角体病毒的制备方法、重组腺相关病毒制备系统和制备方法。
2、本专利技术的具体技术方案如下：
3、本专利技术一方面提供一种单一重组家蚕核型多角体病毒的制备方法，所述制备方法选自方法1-3中的一种：
4、方法1：将单一bmnpv-raav重组杆粒转染低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞，拯救出子一代(p1)出芽型重组家蚕核型多角体病毒(rbmnpv(budded virus)-raav,rbmbev-raav)，即为单一重组家蚕核型多角体病毒；
5、方法2：将单一bmnpv-raav重组杆粒转染低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞，拯救出p1代rbmbev-raav；将p1代rbmbev-raav感染低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞，得到子代rbmbev-raav，即为单一重组家蚕核型多角体病毒；
6、方法3：将单一bmnpv-raav重组杆粒转染低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞，拯救出p1代rbmbev-raav；将p1代rbmbev-raav感染低血清悬浮培养bmn细胞，得到子代rbmbev-raav，即为单一重组家蚕核型多角体病毒；
7、所述单一bmnpv-raav重组杆粒包含重组腺相关病毒核心表达元件itr-goi、rep基因表达框和cap基因表达框。
8、进一步地，所述低血清悬浮培养bmn细胞为在含有体积百分含量2％胎牛血清的培养基中悬浮培养的bmn细胞；
9、和/或，所述低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞为在含有体积百分含量10％胎牛血清的grace补充昆虫培养基中贴壁生长的低血清悬浮培养bmn细胞。
10、进一步地，所述低血清悬浮培养bmn细胞的制备包括：bmn细胞首先被驯化至含有体积百分含量10％胎牛血清的grace补充昆虫培养基中贴壁生长，接着被贴壁驯化至胎牛血清含量逐级降低的昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，之后再被悬浮驯化至胎牛血清含量逐级降低的昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，最终bmn细胞稳定在胎牛血清体积百分含量为2％的昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，所得细胞即为低血清悬浮培养bmn细胞；
11、优选地，所述昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中额外添加hypep 1510；
12、优选地，所述hypep 1510的体积百分含量为0.5％；
13、优选地，所述bmn细胞贴壁驯化与悬浮驯化的胎牛血清体积百分含量阈值为5％，即混合培养基中胎牛血清体积百分含量低于5％时贴壁培养的bmn细胞转悬浮培养；
14、优选地，所述胎牛血清体积百分含量逐级降低的梯度为10％、7.5％、5％、3％、2％。
15、进一步地，所述低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞的制备包括：将所述低血清悬浮培养bmn细胞加入含有体积百分含量10％胎牛血清的grace补充昆虫培养基中贴壁培养，制备得到处于对数生长期、75％～85％融合且均匀分布、状态良好的bmn贴壁细胞，即为低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞。
16、进一步地，驱动重组腺相关病毒cap基因和rep基因表达的启动子来源于acmnpv；
17、优选地，驱动cap基因表达的启动子为pp10；
1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单一重组家蚕核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自方法1-3中的一种：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养BMN细胞为在含有体积百分含量2％胎牛血清的培养基中悬浮培养的BMN细胞；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养BMN细胞的制备包括：BMN细胞首先被驯化至含有体积百分含量10％胎牛血清的Grace补充昆虫培养基中贴壁生长，接着被贴壁驯化至胎牛血清含量逐级降低的昆虫细胞无血清培养基与Grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，之后再被悬浮驯化至胎牛血清含量逐级降低的昆虫细胞无血清培养基与Grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，最终BMN细胞稳定在胎牛血清体积百分含量为2％的昆虫细胞无血清培养基与Grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，所得细胞即为低血清悬浮培养BMN细胞；
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养BMN细胞的贴壁培养细胞的制备包括：将所述低血清悬浮培养BMN细胞加入含有体积百分含量10％胎牛血清的Grace补充昆
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，驱动重组腺相关病毒Cap基因和Rep基因表达的启动子来源于AcMNPV；
6.权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的单一重组家蚕核型多角体病毒。
7.一种重组腺相关病毒制备系统，其特征在于，所述重组腺相关病毒制备系统包括：a)权利要求1所述的低血清悬浮培养BMN细胞和/或权利要求1所述的低血清悬浮培养BMN细胞的贴壁培养细胞，b)重组家蚕核型多角体病毒，所述重组家蚕核型多角体病毒感染宿主细胞或宿主至少可产生重组腺相关病毒包装所需的功能蛋白。
8.根据权利要求7所述的重组腺相关病毒制备系统，其特征在于，所述重组家蚕核型多角体病毒为权利要求6所述的单一重组家蚕核型多角体病毒。
9.一种重组腺相关病毒制备方法，其特征在于，采用权利要求7所述制备系统进行重组腺相关病毒制备，所述制备方法包括如下步骤：将所述重组家蚕核型多角体病毒感染权利要求1所述低血清悬浮培养BMN细胞，或者将所述重组家蚕核型多角体病毒感染权利要求1所述低血清悬浮培养BMN细胞的贴壁培养细胞，感染结束后分别收集培养上清液体和细胞沉淀，裂解细胞沉淀经分离纯化获得重组腺相关病毒。
10.根据权利要求9所述的重组腺相关病毒制备方法，其特征在于，所述细胞沉淀采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化；
...【技术特征摘要】
1.一种单一重组家蚕核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自方法1-3中的一种：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养bmn细胞为在含有体积百分含量2％胎牛血清的培养基中悬浮培养的bmn细胞；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养bmn细胞的制备包括：bmn细胞首先被驯化至含有体积百分含量10％胎牛血清的grace补充昆虫培养基中贴壁生长，接着被贴壁驯化至胎牛血清含量逐级降低的昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，之后再被悬浮驯化至胎牛血清含量逐级降低的昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，最终bmn细胞稳定在胎牛血清体积百分含量为2％的昆虫细胞无血清培养基与grace补充昆虫培养基组成的混合培养基中，所得细胞即为低血清悬浮培养bmn细胞；
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞的制备包括：将所述低血清悬浮培养bmn细胞加入含有体积百分含量10％胎牛血清的grace补充昆虫培养基中贴壁培养，制备得到处于对数生长期、75％～85％融合且均匀分布、状态良好的bmn贴壁细胞，即为低血清悬浮培养bmn细胞的贴壁培养细胞。
5.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：文鹏杰，王培培，徐富强，齐玉祥，朱珍香，韩丹，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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