【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种基于糖和高溶菌酶的革兰阳性菌质粒提取方法。
技术介绍
1、质粒dna(pdna)是基因工程常用的载体。joseph.sambrook提出的碱裂解法是实验室制备pdna最常用的方法，但这种方法在提取厚细胞壁的革兰阳性菌pdna时效果大大降低。例如，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)是革兰阳性菌，通常含有多种天然质粒，例如，l.plantarum pc518，l.plantarum ll441，l.plantarum ngri0101，l.plantarum g63等。使用市面上商业化试剂盒提取这些质粒的效果并不好。因此，本领域仍然需要开发新的革兰阳性菌质粒提取方法。
2、针对这一问题，研究者们通过尝试对细胞壁破壁方法进行改良以提高pdna产量。据文献报道，j.frere等人提出的使用玻璃珠结合较短时间的涡流有助于克服破壁困难。hrahnama等人提出的基于磁性纳米颗粒的质粒dna提取方法仍不能有效解决细胞壁破壁的问题。专利技术人的课题组也曾提出了一种含溶菌酶去除步骤的植物乳杆菌pdna提取方法(analytical biochemistry 2018,566.)。然而为了提升质粒的提取效率，这些方法的步骤流程和工艺参数等的进一步优化仍然是本领域的重要课题。
技术实现思路
1、针对现有技术的问题，本专利技术提供一种革兰阳性菌质粒提取方法，目的在于通过对质粒提取方法的步骤流程和工艺参数进行改进，提高质粒的提取效率。
2、一种革兰阳性菌前处理方法，包括如下步骤：
3、步骤1，将溶菌酶与革兰阳性菌的菌体混合，温育；其中，所述溶菌酶的浓度为100–300mg/ml；
4、步骤2，离心收集菌体；其中，所述离心的离心力为4000-13000g。
5、优选的，步骤1中，所述溶菌酶的浓度为200mg/ml。
6、优选的，步骤1中，所述温育过程中还加入质量百分数为4-6％的糖溶液。
7、优选的，所述糖溶液为单糖或二糖的溶液。
8、优选的，所述糖溶液为葡萄糖的溶液。
9、优选的，步骤2中，所述离心的离心力为7000g。
10、优选的，所述革兰氏阳性菌选自植物乳杆菌或金黄色葡萄球菌。
11、优选的，所述植物乳杆菌选自l.plantarum pc518、l.plantarum 9l15或l.plantarum js193；
12、所述金黄色葡萄球菌选自s.aureus usa300。
13、本专利技术还提供一种革兰阳性菌质粒提取方法，包括如下步骤：
14、步骤a，按照上述革兰阳性菌前处理方法处理革兰阳性菌，得到菌体；
15、步骤b，从所述菌体中提取质粒。
16、优选的，步骤b中，采用革兰阴性菌质粒提取试剂盒从所述菌体中提取质粒。
17、优选的，步骤b中，采用omega质粒提取试剂盒从所述菌体中提取质粒。
18、本专利技术还提供上述革兰阳性菌质粒提取方法得到的质粒。
19、本专利技术优化了现有技术中提取革兰阳性菌质粒的方法，针对前处理步骤，优化了溶菌酶浓度和分离菌体的离心力等工艺参数，提高质粒(pdna)的提取效率。在优选方案中，前处理步骤进一步加入糖溶液平衡细胞内外的渗透压，不仅能再次提高破壁效率，也能控制细胞内物质的释放；此外，采用温和去除溶菌酶的条件(例如：较低的离心力和对分离菌体不进行洗涤)，可进一步提高质粒的得率。提取实验结果表明，提取得到的植物乳杆菌pc518菌株pdna的浓度高达590.8±31.9ng/ul，其水平已接近于革兰阴性菌pdna提取的浓度600-800ng/ul。因此，本专利技术具有很好的应用前景。
20、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
21、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
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1.一种革兰阳性菌前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.按照权利要求1所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：步骤1中，所述溶菌酶的浓度为200mg/ml。
3.按照权利要求1所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：步骤1中，所述温育过程中还加入质量百分数为4-6％的糖溶液。
4.按照权利要求3所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：所述糖溶液为单糖或二糖的溶液。
5.按照权利要求4所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：所述糖溶液为葡萄糖的溶液。
6.按照权利要求1所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：步骤2中，所述离心的离心力为7000g。
7.按照权利要求1所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：所述革兰氏阳性菌选自植物乳杆菌或金黄色葡萄球菌。
8.按照权利要求8所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：所述植物乳杆菌选自L.plantarum PC518、L.plantarum 9L15或L.plantarum JS193；
9.一种革兰阳性菌质粒提取方法，其特征在于，包
10.权利要求9所述革兰阳性菌质粒提取方法得到的质粒。
...【技术特征摘要】
1.一种革兰阳性菌前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.按照权利要求1所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：步骤1中，所述溶菌酶的浓度为200mg/ml。
3.按照权利要求1所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：步骤1中，所述温育过程中还加入质量百分数为4-6％的糖溶液。
4.按照权利要求3所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：所述糖溶液为单糖或二糖的溶液。
5.按照权利要求4所述的革兰阳性菌前处理方法，其特征在于：所述糖溶液为葡萄糖的溶液。
6.按照权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘渠，张雨萌，刘芳，焦秋霞，姚芳，
申请(专利权)人：成都医学院，
类型：发明
国别省市：
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