【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及糖基化外泌体与蛋白标志物联合在制备诊断或预后评估肿瘤的产品中的应用。
技术介绍
1、目前，临床的肿瘤检测技术主要依赖组织活检，然而组织活检具有创伤性，难以动态检测，甚至有引起肿瘤播散的风险，液体活检(liquid biopsy)是一种新兴的无创检测方法，近年来在癌症的早期诊断、治疗检测和预后评估中受到了广泛关注和研究。其中，外泌体(exosome)是由所有类型细胞主动分泌，能够在血液中稳定大量存在的脂质双分子层纳米颗粒，参与细胞通讯、细胞迁移、肿瘤细胞增长等多种过程，完成细胞间物质及信息的传递。外泌体与肿瘤、慢性感染性疾病、自身免疫病等多种疾病相关，当机体发生病变时，细胞分泌的外泌体的成分、含量、性质等都可能发生改变。
2、糖基化是蛋白质的重要翻译后修饰之一，是通过糖基转移酶在内质网和高尔基体上发生的过程，它能将糖苷连接到其他糖分子、蛋白质或脂质上。肿瘤细胞相较于非肿瘤细胞表现出更为异常的糖基化变化。这些特定蛋白质和脂质的糖基化水平增加，增强了肿瘤在分子水平上的异质性，同时促进了其发展。糖基化外泌体在肿瘤的诊断或预后评估中的研究重点主要是糖链结构的变化，cn105628934a中针对血清样本，采用特定的凝集素组合制备诊断肺癌类型的测试载体，以不同糖蛋白的糖链结构作为肺癌亚型的诊断标准，有效鉴别出肺癌的类型及分期。zhang等(zhang j，qin y，jiang q，et al.glycopatternalteration of glycoproteins in gastrointe
3、糖链结构直接参与了多种疾病的病理生理过程，但在不同肿瘤中糖链结构发生的改变不同，这显然难以将单一糖链结构的变化拓展至其他的肿瘤中。
4、因此，本申请利用特定凝集素分离糖基化外泌体，检测蛋白标志物实现精准化肿瘤诊断，对于临床研究具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术利用特定凝集素分离特定糖基化外泌体，然后检测其蛋白标志物的表达水平实现肿瘤的早期诊断，解决了现有技术中每种抗原都需要生产对应抗体的复杂性，更提高了诊断效果。最令人意外的是，通过采用不同的算法分析特定凝集素分离的外泌体上蛋白标志物的表达可以显著提到诊断效果，auc甚至可以接近1。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种糖基化外泌体与蛋白标志物联合在制备诊断或预后评估肿瘤的产品中的应用。
3、所述糖基化的类型包括n-糖基化、o-糖基化、c-糖基化或糖基磷脂酰肌醇锚定中的一种或两种以上。
4、所述糖基化的结构包括fuc、sia、man、glcnac、galnac或gal中的一种或两种以上；
5、优选的，所述糖基化的结构为sia、man或galnac中的一种或两种以上。
6、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的糖基化为n-糖基化的sia、o-糖基化的glcnac、n-糖基化的galnac和n-糖基化的man。
7、所述的蛋白标志物为现有技术中肿瘤的蛋白标志物，例如在肿瘤患者和非肿瘤患者的肿瘤细胞、外泌体、血液或血浆中表达水平具有显著差异的蛋白，又例如在肿瘤患者的肿瘤细胞、外泌体、血液或血浆中特异性表达，在非肿瘤患者不表达的蛋白。例如包括但不限于epcam、cea、ca19-9、ca12、dsg3、galnac-t3、fat2、icam-1、cd44、pd-1、pd-l1、il-3、ido1、gbp1、irf1、ifit1、ifit2或gzmb中的一种或两种以上，优选的，所述的蛋白标志物为epcam。
8、所述的糖基化外泌体与蛋白标志物联合包括获取糖基化外泌体，然后检测蛋白标志物。
9、所述的诊断或预后评估肿瘤包括分离样本中糖基化外泌体，并检测糖基化外泌体的蛋白标志物。
10、所述的样本包括血清、血浆、唾液、胃液、细胞培养上清、脑脊液或淋巴液中的一种或两种以上。
11、优选的，所述的细胞包括肿瘤细胞和/或上皮细胞。优选为上皮来源的肿瘤细胞。
12、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的样本为血浆。
13、所述的分离样本中糖基化外泌体包括使用凝集素分离糖基化外泌体。
14、所述的凝集素包括cpogad298n、dba或npa中的一种或两种以上；优选的，所述的凝集素为cpogad298n、dba和npa。
15、所述的cpogad298n特异性识别的糖基化为n-糖基化的sia和/或o-糖基化的glcnac。
16、所述的dba特异性识别的糖基化为n-糖基化的galnac。
17、所述的npa特异性识别的糖基化为n-糖基化的man。
18、所述的使用凝集素分离糖基化外泌体包括制备凝集素-固相载体偶联复合物。
19、所述的制备凝集素-固相载体偶联复合物包括：
20、步骤一：将edc、nhs与固相载体混合均匀，离心后去上清；
21、步骤二：将凝集素经超声溶解后，加入步骤一的混合物中，离心后去上清，获得凝集素-固相载体偶联复合物。
22、其中，凝集素与固相载体以(0.5-3)：(5-20)的质量比混合，优选的，所述的凝集素与固相载体以1：10的质量比混合。
23、所述的固相载体包括酶标板、膜载体、微球或磁珠。
24、所述的步骤一中离心的离心力为2000-4000rpm，优选的，所述的离心力为2500-3500rpm，例如2000rpm、2200rpm、2400rpm、2600rpm、2800rpm、3000rpm、3200rpm、3400、3600、3800、4000rpm。
25、所述的步骤一中离心的时间为1-10min，优选的，所述的离心时间为2-8min，例如1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min。
26、所述步骤二中超声的时间为0.1-5min，优选的，所述的超声的时间为0.5-5min，例如0.1min、0.5min、1min、2min、3min、4min、5min。
27、步骤二中将凝集素经超声溶解后，加入步骤一的混合物中后，在摇床上震荡摇匀0.5-3h，优选的，所述的震荡摇匀的时间为0.5-2h，例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h。
28、步骤二中离心的离心力为2000-4000，所述的离心力为2500-350本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.糖基化外泌体与蛋白标志物联合在制备诊断或预后评估肿瘤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖基化的类型包括N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化或糖基磷脂酰肌醇锚定中的一种或两种以上；
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蛋白标志物包括EpCAM、CEA、CA19-9、CA12、DSG3、GalNac-T3、FAT2、ICAM-1、CD44、PD-1、PD-L1、IL-3、IDO1、GBP1、IRF1、IFIT1、IFIT2或GZMB中的一种或两种以上，优选的，所述的蛋白标志物为EpCAM。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后评估肿瘤包括分离样本中糖基化外泌体，并检测糖基化外泌体的蛋白标志物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样本包括血清、血浆、唾液、肿瘤细胞培养上清、胃液、脑脊液或淋巴液中的一种或两种以上。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的分离样本中糖基化外泌体包括使用凝集素分离糖基化外泌体；优选的，所述的凝集素包括CpOGA
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后评估肿瘤包括利用肿瘤的诊断模型，所述的诊断模型利用K最邻近算法、逻辑回归、支持向量机、极端梯度提升算法或最小绝对收缩和选择算法中的任一种算法依据蛋白标志物表达数据构建。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、结肠癌、卵巢癌或肉瘤。
9.一种肿瘤的诊断模型，其特征在于，所述的诊断模型包括：
10.一种权利要求9所述的诊断模型在制备诊断或预后评估肿瘤的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.糖基化外泌体与蛋白标志物联合在制备诊断或预后评估肿瘤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖基化的类型包括n-糖基化、o-糖基化、c-糖基化或糖基磷脂酰肌醇锚定中的一种或两种以上；
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蛋白标志物包括epcam、cea、ca19-9、ca12、dsg3、galnac-t3、fat2、icam-1、cd44、pd-1、pd-l1、il-3、ido1、gbp1、irf1、ifit1、ifit2或gzmb中的一种或两种以上，优选的，所述的蛋白标志物为epcam。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后评估肿瘤包括分离样本中糖基化外泌体，并检测糖基化外泌体的蛋白标志物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样本包括血清、血浆、唾液、肿瘤细胞培养上清、胃液、脑脊液或淋巴液中的一种或两...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐陈洁，卜凡钦，詹浩苏，闵力，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：
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