【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及萜类化合物、特别是玫瑰芳香分子的生物合成。
技术介绍
1、玫瑰油富含挥发性分子，其中单萜在特征性玫瑰气味中起着至关重要的作用。香叶醇是一种具有玫瑰样气味和味道的单萜醇，是一种重要的商用香料和香精分子。香叶醇及其酯衍生物乙酸香叶酯是玫瑰油中最重要的两种单萜。香叶醇广泛用于除臭剂、香水和美容霜中，也是一种哺乳动物毒性低和可生物降解性的有效植物基驱蚊剂和杀虫剂。香叶醇的酯衍生物即乙酸香叶酯，因其花香和果香而广泛应用于化妆品行业。
2、然而，这些分子只在植物内以低浓度产生。目前，香叶醇和乙酸香叶酯主要通过化学合成产生，化学合成是不可持续和不环保的。此外，消费者对天然成分或生物成分的需求在不断增加。因此，对开发产生香叶醇和乙酸香叶酯的生物技术路线越来越感兴趣，近年来，开发了产生香叶醇的生物技术路线。这些路线大多数使用植物香叶醇合酶(geraniolsynthase,ges)，这些酶在微生物中的溶解度和/或活性不足，从而限制了香叶醇的产率。因此，需要提供克服或至少改善一个或多个上述缺点的香叶醇和乙酸香叶酯生物合成的方法和系统。
技术实现思路
1、一方面，本文提供了包含一个或多个载体的宿主细胞，该载体包含编码甲羟戊酸途径的一个或多个基因和nudix途径的一个或多个基因的多核苷酸序列。
2、另一方面，本文提供了工程融合蛋白，包含甲羟戊酸途径的二磷酸合酶或异戊烯转移酶(prenyltransferase)，和nudix水解酶；或甲羟戊酸途径的二磷酸合酶或异戊烯转
3、另一方面，本文提供了产生香叶醇、乙酸香叶酯或香叶醇和乙酸香叶酯的方法，包括在培养基中培养本文所述的宿主细胞，其中培养基包含诱导剂和至少一种碳基质(carbon substrate)。
4、另一方面，本文提供了用于产生香叶醇、乙酸香叶酯或香叶醇和乙酸香叶酯的试剂盒，其中该试剂盒包括本文所述的宿主细胞和使用说明。
5、定义
6、本文所用术语“类异戊二烯”是指由两个或多个碳氢化合物单元组成的大型和多样化的天然存在的有机化合物类，每个单元都由以特定模式排列的五个碳原子组成。
7、本文所用术语“单萜”或“单萜类化合物”是指通过各种单萜合酶由香叶基二磷酸产生的一类类异戊二烯。单萜类化合物具有两个类异戊二烯单元。单萜是植物的次级代谢产物，是精油、化妆品、食品调味品、清洁产品和药品的主要成分。它们提供植物的特定气味特征。单萜在工业上用作香料、香料和化妆品成分。此外，它们是香茅醇、香叶醇、薄荷醇和马鞭草烯醇等几种风味化合物的前体。
8、本文所用术语“甲羟戊酸途径”是指，通过合成胆固醇等固醇异戊二烯和多帖醇、血红素a、异戊烯基trna和泛醌等非固醇异戊二烯，在多个细胞过程中发挥关键作用的细胞代谢途径。甲羟戊酸途径是第一个受到承认的异戊烯基焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,ipp)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,dmapp)生物合成途径，它涉及将乙酰-coa转化为ipp的一系列6个酶促步骤。在甲羟戊酸途径的前两个步骤中，三个乙酰-coa分子缩合，合成甲羟戊酸。乙酰乙酰-coa硫解酶和hmg–coa合酶(hmg–coa synthase,hmgs)催化缩合反应，形成羟甲基戊二酰-coa(hydroxymethylglutaryl–coa,hmg-coa)。此外，hmg-coa还原酶(hmg–coa reductase,hmgr)催化hmg-coa还原成甲羟戊酸。因此合成的甲羟戊酸被磷酸化和脱羧形成ipp。磷酸化首先由甲羟戊酸激酶催化，然后在磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase,pmk)的作用下形成甲羟戊酸-5-焦磷酸。脱羧是最后一步，其中磷酸甲羟戊酸脱羧酶催化atp依赖性甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧形成ipp。ipp可以与dhna相互作用形成aq，或与异构酶相互作用通过ipp异构酶(idi)形成dmapp。甲羟戊酸途径基因是指编码甲羟戊酸途径酶的基因。
9、本文所用术语“nudix水解酶”是指水解酶超家族并见于所有类别的生物中。nudix水解酶以不同程度的底物特异性水解多种有机焦磷酸，包括核苷二磷酸和核苷三磷酸、二核苷和二磷酸肌醇多磷酸、核苷酸糖和rna帽。
10、本文所用术语“nudix途径”是指涉及属于nudix酶家族的二磷酸水解酶的代谢途径。胞质内的nudix水解酶(例如atnudx1、nudi、rhnudx1)将香叶基二磷酸(geranyldiphosphate,gpp)转化为香叶基单磷酸(geranyl monophosphate,gp)，然后香叶基单磷酸通过磷酸酶活性水解成香叶醇。nudix途径基因是指编码nudix途径酶的基因。
11、本文所用术语“香叶醇”是指化学式为c10h18o即3,7-二甲基-2,6-八烯-1-醇的无环单萜醇。香叶醇可以由芳香植物产生。香叶醇也可以在工程菌株中生物合成，包括酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
12、本文所用术语“乙酸香叶酯”是作为香叶醇的乙酸酯衍生物的单萜。
13、本文所用术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。
14、本文所用“核酸”是指以单链或双链形式共价连接在一起的两个或多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
15、本文所用术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子)与第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列调节与第二序列相对应的核酸的转录。
16、本文所用术语“变体”是指dna序列中的修饰。dna序列的修饰包括突变、截短、易位、取代、缺失和插入，从而导致基因活性的改变。
17、本文所用术语“启动子”是指启动基因转录的dna区域。该dna区域通常位于基因转录起始位点附近和dna上游。启动子可以是诱导型的或非诱导型的。本文所用术语“诱导型启动子”是指可以响应于特定刺激物(也称为诱导剂)而受到调节的启动子。启动子系统经修饰可以是诱导型的。诱导型启动子系统的实例包括tet-on系统、tet-off系统、t7系统、trp系统、tac系统、λci857-pl系统、细菌el222系统和lac系统。启动子也可以是组成型启动子，组成型启动子是始终有活性的启动子。
18、本文所用术语“核糖体结合位点”在本申请的语境中是指mrna分子募集并结合核糖体的位点，从而允许在翻译起始期间选择适当的起始密码子。核糖体结合位点控制mrna翻译起始的准确性和效率。
19、本文所用术语“接头”是指在重组蛋白或融合蛋白中隔开多个结构域的短氨基酸序列。接头的功能是抑制离散结构域之间不必要的相互作用。然而，有一些灵活的富含gly的接头可以连接单个蛋白质中的各种结构域，而不本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.宿主细胞，包含一个或多个载体，所述载体包含编码甲羟戊酸途径的一个或多个基因和Nudix途径的一个或多个基因的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含两个载体，其中
3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述甲羟戊酸途径的一个或多个基因选自HMG-CoA合酶(hmgS)、乙酰乙酰-CoA硫解酶(atoB)、HMG-CoA还原酶(hmgR)、甲羟戊酸激酶(mevK)、磷酸甲羟戊酸激酶(pmk)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(pmd)和(异戊烯基二磷酸)IPP异构酶(idi)，且所述Nudix途径的一个或多个基因是NUDX1或NudI。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述hmgR基因是截短的。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述第二载体还包含编码所述宿主细胞中的一个或多个二磷酸合酶基因、异戊烯转移酶基因或其组合的多核苷酸序列。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的宿主细胞，其中每个所述载体中的多核苷酸序列都可操作地连接于诱导型启动子，其中所述诱导型启动子是野生型T7 R
7.根据权利要求2-6中任一项所述的宿主细胞，其中所述第一载体包含：
8.根据权利要求5-7中任一项所述的宿主细胞，其中所述第二载体还包含编码核糖体结合位点(RBS)的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列位于以下多核苷酸序列的上游：所述编码Nudix途径基因的多核苷酸序列，所述编码二磷酸合酶基因或异戊烯转移酶基因的多核苷酸序列，或其组合。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述第二载体中编码RBS的多核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的宿主细胞，其中所述二磷酸合酶或异戊烯转移酶是香叶基焦磷酸合酶(GPPS)或法尼基二磷酸合酶(FPPS)。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述GPPS分离自从大冷杉(Abies grandis)(AgGPPS)。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述AgGPPS在N末端是截短的。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述截短的AgGPPS包含SEQ ID NO:7所示的多肽序列。
14.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述FPPS分离自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或大肠杆菌(Escherichia.coli)。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述FPPS在一个或多个氨基酸位置发生了突变。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中来自大肠杆菌的突变FPPS包含SEQ ID NO:9所示的多肽序列，其中来自酿酒酵母的突变FPPS包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQID NO:13所示的多肽序列。
17.根据权利要求2-16中任一项所述的宿主细胞，其中所述NUDX1分离自植物。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述NUDX1分离自现代月季(Rosahybrida)，并且与SEQ ID NO:14所示的多肽序列具有约70％、80％、90％或100％的同一性，或者其中所述NUDX1分离自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，并且与SEQ ID NO:15所示的多肽序列具有约70％、80％、90％或100％的同一性。
19.根据权利要求2-17中任一项所述的宿主细胞，其中所述NudI分离自从原核生物。
20.根据权利要求5-19中任一项所述的宿主细胞，其中所述NUDX1或NudI与所述二磷酸合酶或异戊烯转移酶共表达。
21.根据权利要求5-20中任一项所述的宿主细胞，其中所述第二载体还包含以下中的一个或多个：
22.根据权利要求1-21中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞缺乏pta基因、ackA基因或ackA和pta基因。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞缺乏至少一个参与氨基酸合成、萜类化合物氧化、氨基酸降解或其组合的基因。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞缺乏aroA、serC、yjgB和tnaA基因，或者其中所述宿主细胞缺乏aroA、serC和tnaA基因。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.宿主细胞，包含一个或多个载体，所述载体包含编码甲羟戊酸途径的一个或多个基因和nudix途径的一个或多个基因的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含两个载体，其中
3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述甲羟戊酸途径的一个或多个基因选自hmg-coa合酶(hmgs)、乙酰乙酰-coa硫解酶(atob)、hmg-coa还原酶(hmgr)、甲羟戊酸激酶(mevk)、磷酸甲羟戊酸激酶(pmk)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(pmd)和(异戊烯基二磷酸)ipp异构酶(idi)，且所述nudix途径的一个或多个基因是nudx1或nudi。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述hmgr基因是截短的。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的宿主细胞，其中所述第二载体还包含编码所述宿主细胞中的一个或多个二磷酸合酶基因、异戊烯转移酶基因或其组合的多核苷酸序列。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的宿主细胞，其中每个所述载体中的多核苷酸序列都可操作地连接于诱导型启动子，其中所述诱导型启动子是野生型t7 rna聚合酶启动子或所述野生型t7 rna聚合酶启动子的变体。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的宿主细胞，其中所述第一载体包含：
8.根据权利要求5-7中任一项所述的宿主细胞，其中所述第二载体还包含编码核糖体结合位点(rbs)的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列位于以下多核苷酸序列的上游：所述编码nudix途径基因的多核苷酸序列，所述编码二磷酸合酶基因或异戊烯转移酶基因的多核苷酸序列，或其组合。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述第二载体中编码rbs的多核苷酸序列选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4和seq id no:5。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的宿主细胞，其中所述二磷酸合酶或异戊烯转移酶是香叶基焦磷酸合酶(gpps)或法尼基二磷酸合酶(fpps)。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述gpps分离自从大冷杉(abies grandis)(aggpps)。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述aggpps在n末端是截短的。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述截短的aggpps包含seq id no:7所示的多肽序列。
14.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述fpps分离自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或大肠杆菌(escherichia.coli)。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述fpps在一个或多个氨基酸位置发生了突变。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中来自大肠杆菌的突变fpps包含seq id no:9所示的多肽序列，其中来自酿酒酵母的突变fpps包含seq id no:11、seq id no:12或seqid no:13所示的多肽序列。
17.根据权利要求2-16中任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁健庭，林晶晶，张聪强，苏达·D·D·曼巴哈尔·舒克拉，陈茜娴，R·提，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：
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