【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学和生物学领域，具体的说，本专利技术涉及一种弓形虫gra6和rop2a抗原mrna-lnp疫苗及其应用。
技术介绍
1、弓形虫是一种胞内寄生性顶复门原虫，能感染所有的温血动物。弓形虫病是一种由弓形虫引起的寄生虫病，已在世界范围内流行。免疫正常的人群患弓形虫病后多数没有明显症状；但免疫功能低下的人群感染后较为严重，如发展为心肌炎、肺炎或脑炎；孕妇在孕期的原发性感染可能导致胎儿先天性畸形或脑病，甚至死亡。
2、在弓形虫病的治疗方面，目前常用的是乙胺嘧啶和磺胺嘧啶的组合，这两种药物通过叶酸代谢的两个步骤协同作用；还有其他疗法如将前者与克林霉素、阿奇霉素或阿托伐醌联合使用。尽管在过去十年中，利用高通量筛选策略发现新的化学物质，包括具有抗虫活性的天然产物；或重新利用或改进现有的批准药物用于治疗弓形虫病。虽然药物是治疗的主要策略，但它们耐受性差，具有严重的副作用和耐药性，并且不能对抗弓形虫病的慢性感染阶段。因此，开发有效和安全的对弓形虫急慢性感染均有效的疫苗是重要且紧迫的。
3、理想的弓形虫疫苗应当具有高的免疫保护力和低的毒力，减毒活疫苗保护率低且存在毒力返强的风险，灭活疫苗无法诱导有效的抗虫免疫；dna疫苗较前两种而言，经济效益、生物相容性和稳定性更高，但免疫原性较差；蛋白质疫苗的保护作用有限且成产成本较高。和前几种疫苗相比，mrna疫苗安全性更高，能在胞内快速摄取和表达，但因为mrna容易被核糖核酸酶降解，需要在设计和生产时对其序列和结构进行优化，并且使用有效的递送载体将其送入胞质内。虽然已知脂
4、rna疫苗相对传统的几种疫苗，其成本低，效益高，体现在以下几个方面。首先，研发和生产快速：rna疫苗所用序列可以在数据库中选择，rna转录及疫苗制备过程为纯化学反应过程，不需经过细胞或其他生物反应(蛋白质疫苗需经过原核表达，dna疫苗需真核表达)，这不仅节约了时间和资金，还减少了杂质的引入；rna生产体系建立后，生产新的rna疫苗时只需更换序列，后续步骤可不变。rna疫苗单次使用剂量少：蛋白疫苗免疫每只小鼠需3次共计200μg，dna疫苗每只小鼠需20至100μg不等，而rna疫苗只需10-20μg/鼠。rna疫苗可优化途径多：rna序列有多种优化途径，包括两端utr区和5’帽子结构的选择，密码子优化等，经过修饰和改造后的rna表达效率大幅提高；并且lnp的使用能使rna疫苗的表达效率再进一步提高。
5、mrna-lnp目前被越来越多地用于人用传染病和肿瘤疫苗的研制，但在兽用疫苗，尤其是寄生虫疫苗的应用很少。弓形虫作为宿主范围最广的一类寄生虫病，长久以来都未得到有效的控制，针对弓形虫的灭活疫苗、dna疫苗和蛋白质疫苗都已在文献中出现，但都只停留在实验室阶段，还未实现真正投入临床使用的有效弓形虫疫苗。原因不仅在于免疫原性较差、安全性不足的缺点，还需要考虑一个很重要的因素—成本效益。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术首先提供一种对弓形虫多个感染阶段均有保护性的抗原，所述抗原为弓形虫多阶段均表达的gra6和rop2a，其中，gra6和rop2a都进行了氨基酸残基的改造，其中所述改造后的gra6的核苷酸序列为seq id no.4所示；所述改造后的rop2a的核苷酸序列为seq id no.5所示；
2、进一步的，本专利技术提供一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒由四种脂质组成，分别是4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二甲油基)甲酯(dlin-mc3-dma)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)，胆固醇(cho-hp)和培化二肉豆蔻酸甘油酯2000(dmg-peg2000)；
3、进一步的，上述四种材料的摩尔比分别为：50:10:38.5:1.5或者为50:10:37.5:2.5；
4、进一步的，本专利技术提供一种上述脂质纳米颗粒的制备方法，具体为将上述四种成分按照一定摩尔比加入无水乙醇中，总浓度为8mg/ml，震荡数分钟使其完全溶解。
5、进一步的，本专利技术提供一种组合物，其包含至少一种脂质纳米颗粒；其中该脂质纳米颗粒囊封具有编码至少一种目的多肽之可读框的核糖核酸(rna)多核苷酸，其中该至少一种目的多肽包含抗原；
6、优选的，上述多肽为gra6和/或rop2a。
7、进一步的，本专利技术提供一种上述组合物在制备能够诱发细胞的免疫应答的药物中的用途。
8、进一步的，本专利技术提供一种上述组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、诊断、治疗或改善哺乳动物受试者中疾病、病症、异常病况或功能障碍。
9、优选的，所述药物为治疗和/或预防弓形虫的药物。
10、优选的，所述哺乳动物受试者选自人类、非人灵长类动物、伴侣动物、外来物种、家畜动物和供食用动物中的一种或多种。
11、进一步的，本专利技术提供一种弓形虫疫苗，所述疫苗中含有上述组合物。
12、有益效果
13、本专利技术所涉及到的弓形虫致密颗粒蛋白(gra6)由致密颗粒分泌，定位于弓形虫纳米管网络(ivn)和纳虫泡膜(pvm)，可调控宿主免疫相关的信号通路和基因表达，进而控调细胞因子的表达。gra6还会影响包囊的形成，因为ivn的生物发生需要gra6，而ivn对囊壁和囊膜的发育和成熟至关重要。弓形虫棒状体蛋白2(rop2)由棒状体分泌，为单拷贝基因，其蛋白中富含脯氨酸和精氨酸，含有n端信号肽和c端的跨膜结构域。rop2基因在弓形虫速殖子、缓殖子、子孢子等阶段都能表达，并诱导t细胞克隆增生，以应对弓形虫入侵；此外，其还可刺激产生t淋巴细胞介导的细胞免疫反应及相关细胞因子，在弓形虫入侵宿主细胞过程中，rop2发挥着联系宿主细胞和pv的作用。
14、而借助上述两个抗原进一步制备得到mrna-lnp疫苗，能够诱导小鼠产生特异性抗体，抗体水平随免疫次数的增加而上升，而且疫苗免疫组的小鼠脾细胞活性均显著高于对照组，表明mrna-lnp疫苗能刺激小鼠脾细胞增殖，增强脾细胞活性。而且免疫组的il-2，il-4，il-5，ifn-γ和tnf-α水平均显著高于对照组，说明mrna-lnp的免疫能刺激小鼠脾细胞产生细胞因子，增强细胞免疫反应。而且动物试验证实，三组免疫组小鼠的存活率和存活时间均高于对照组，而且gra6 mrna-lnp免疫组和rop2a mrna-lnp免疫组达到了100％的免疫保护率，表明mrna-lnp疫苗能保护小鼠免受致命的弓形虫攻击，延长小鼠感染弓形虫后的生存时间。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种对弓形虫多个感染阶段均有保护性的抗原，其特征在于，所述抗原为改造后的弓形虫GRA6和ROP2A，其中所述改造后的GRA6的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；所述改造后的ROP2A的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
2.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒由四种脂质组成，分别是4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二甲油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇(CHO-HP)和培化二肉豆蔻酸甘油酯2000(DMG-PEG2000)。
3.如权利要求2所述的一种脂质纳米颗粒，其中四种材料的摩尔比分别为：50:10:38.5:1.5或者为50:10:37.5:2.5。
4.一种权利要求2或3所述的脂质纳米颗粒的制备方法，具体为：将上述四种成分按照一定摩尔比加入无水乙醇中，总浓度为8mg/mL，震荡数分钟使其完全溶解。
5.一种组合物，其包含权利要求2或3所述的一种脂质纳米颗粒；其中该脂质纳米颗粒囊封具有编码至少一种目的多肽之可读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，其中该至少一种目的多肽包含抗原
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述抗原为权利要求1中的GRA6和/或ROP2A。
7.权利要求6所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、诊断、治疗或改善哺乳动物受试者中疾病、病症、异常病况或功能障碍，所述药物为治疗和/或预防弓形虫的药物。
8.一种弓形虫疫苗，其特征在于所述疫苗中含有权利要求1所述的抗原、和/或权利要求6所述的组合物。
...【技术特征摘要】
1.一种对弓形虫多个感染阶段均有保护性的抗原，其特征在于，所述抗原为改造后的弓形虫gra6和rop2a，其中所述改造后的gra6的核苷酸序列为seq id no.4所示；所述改造后的rop2a的核苷酸序列为seq id no.5所示。
2.一种脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒由四种脂质组成，分别是4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二甲油基)甲酯(dlin-mc3-dma)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)，胆固醇(cho-hp)和培化二肉豆蔻酸甘油酯2000(dmg-peg2000)。
3.如权利要求2所述的一种脂质纳米颗粒，其中四种材料的摩尔比分别为：50:10:38.5:1.5或者为50:10:37.5:2.5。
4.一种权利要求2或3所述的脂质纳米...
【专利技术属性】
技术研发人员：张厚双，李冰洁，周金林，曹杰，周勇志，王亚楠，张凯，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：
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