【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，特别是涉及一种特异性识别展青霉素的核酸适配体及其筛选方法与应用。
技术介绍
1、展青霉素(patulin，缩写pat)是一种由青霉属真菌产生的次级代谢产物，最初作为广谱抗生素进行研究，但其毒理学实验表明pat具有影响生育、致癌和免疫等毒理作用。pat在苹果、山楂等水果及相应制品中广泛存在，且水果在实际运输及贮存过程中，极易受到真菌污染，在加工成相应制品过程当中，毒素进一步积累。我国食品安全国家标准对食品中的pat进行了明确的限量，为50μg/kg。因此，有必要长期监测农产品中pat的残留，对保护人类健康具有十分重要的意义。
2、pat污染的主要对象为水果及相应制品，而水果在现有市场中需求量极大。因而，监测方法必须快速便捷。目前真菌毒素快速检测普遍应用的是酶免疫分析试剂盒。试剂盒的核心试剂是抗体。但抗体制备过程极其复杂、存在制备周期长、批次差异性大的缺陷，而且由于pat分子量小，在动物体内的不稳定性，容易与亲核物质结合，所以难以制备针对pat的高特异性抗体。因此，寻找与抗体功能类似的识别分子具有极其重要的意义。
3、核酸适配体是通过体外指数富集技术(selex)筛选制备的单链dna或rna，有特异性强、亲和力高、靶标范围广和易修饰等优点。在食品安全检测领域具有极其广阔的应用前景。但就食品中小分子危害物而言，制备其特异性核酸适配体是亟待解决的瓶颈问题。因而，筛选出识别食品中小分子危害物的核酸适配体十分有必要。
4、与生物大分子相比，筛选识别小分子危害物的核酸适配体相对困
技术实现思路
1、基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种特异性识别展青霉素的核酸适配体及其筛选方法与应用。
2、第一个方面，本申请提供了一种特异性识别展青霉素的核酸适配体，包括的核苷酸序列为：5’gggacgacgggttacctagtgggcgcaagccatacggagtcgtccc3’。
3、第二个方面，本申请提供了一种特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，进行十八轮核酸适配体筛选，每轮核酸适配体筛选包括如下步骤：
4、将人工合成的ssdna文库以selex缓冲液溶解后加入biotin引物，得到第一混合物；
5、将所述第一混合物加入到链霉亲和素树脂中，再用所述selex缓冲液洗涤若干次后，加入200μm的展青霉素，收集流出液。经纯化后进行pcr扩增，产物再加入链霉亲和素树脂于室温中孵育，加入0.2m的氢氧化钠回收洗脱液，完成一轮核酸适配体筛选。
6、在第二个方面的某些实现方式中，所述回收洗脱液的步骤之后，还包括：
7、将所述洗脱液加入超滤管中浓缩，体系溶液替换为水，将得到的浓缩液加入乳浊液pcr mix中进行pcr扩增；
8、收集pcr扩增后的产物并浓缩，体系溶液替换为separation缓冲液，将浓缩后的产物固定在树脂上后用separation缓冲液洗涤若干次，得到第二混合物；
9、在所述第二混合物中加入0.2m氢氧化钠，收集流出液，再加入所述链霉亲和素树脂于室温中孵育，回收洗脱液，再用盐酸中和得到中和液，对所述中和液进行浓缩，体系溶液替换为selex缓冲液。
10、结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，所述separation缓冲液包含250mm的nacl和50mm的hepes，ph值为7.5。
11、结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，所述selex缓冲液包含500mm的nacl、10mm的mgcl2和50mm的hepes，ph值为7.5。
12、结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，所述biotin引物与所述ssdna文库的摩尔比为5:1。
13、结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，在所述核酸适配体筛选的第13轮至第18轮筛选中，所述加入200μm的展青霉素的步骤之前还包括，加入赭曲霉毒素a和细交链孢菌酮酸。
14、结合第二个方面和上述实现方式，在第二个方面的某些实现方式中，第一轮筛选用的所述ssdna文库的用量为500pmol，后面各轮筛选的所述ssdna文库的用量为100-400pmol。
15、第三个方面，本申请提供了一种特异性识别展青霉素的核酸适配体的应用方法，将通过如本申请第二个方面中任一项所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法筛选出的高亲和力的核酸适配体劈裂成两段，将两段劈裂的人端粒g四链体片段添加到末端，用于构建劈裂型传感器。
16、本专利技术提供的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法采用将文库固定于树脂上，利用游离的小分子去捕获树脂上的核酸适配体，不仅文库固定效率高，也更能筛选出特异性识别靶标的核酸适配体，另外，利用筛选得到的适配体构建了一种基于劈裂型适配的传感器，来特异性地检测pat，更好地为实际样品中的pat检测提供新的思路。
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1.一种特异性识别展青霉素的核酸适配体，其特征在于，包括的核苷酸序列为：
2.一种特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，进行十八轮核酸适配体筛选，得到如权利要求1所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体；每轮核酸适配体筛选包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述回收洗脱液的步骤之后，还包括：
4.根据权利要求3中所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述Separation缓冲液包含250mM的NaCl和50mM的HEPES，pH值为7.5。
5.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述SELEX缓冲液包含500mM的NaCl、10mM的MgCl2和50mM的HEPES，pH值为7.5。
6.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述biotin引物与所述ssDNA文库的摩尔比为5:1。
7.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特
8.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，第一轮筛选用的所述ssDNA文库的用量为500pmol，后面各轮筛选的所述ssDNA文库的用量为100-400pmol。
9.一种特异性识别展青霉素的核酸适配体的应用方法，其特征在于，将通过如权利要求2～8中任一项所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法筛选出的高亲和力的核酸适配体劈裂成两段，将两段劈裂的人端粒G四链体片段添加到末端，用于构建劈裂型传感器。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性识别展青霉素的核酸适配体，其特征在于，包括的核苷酸序列为：
2.一种特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，进行十八轮核酸适配体筛选，得到如权利要求1所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体；每轮核酸适配体筛选包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述回收洗脱液的步骤之后，还包括：
4.根据权利要求3中所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述separation缓冲液包含250mm的nacl和50mm的hepes，ph值为7.5。
5.根据权利要求2所述的特异性识别展青霉素的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述selex缓冲液包含500mm的nacl、10mm的mgcl2和50mm的hepes，ph值为7.5。
6.根据权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘细霞，程家欣，刘世昕，刘焕，李永淑，侯建军，吴琴，
申请(专利权)人：湖北师范大学，
类型：发明
国别省市：
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