【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及轮状病毒假病毒标准物质，特别是涉及一种g9p8轮状病毒假病毒标准物质、制备方法和应用。
技术介绍
1、轮状病毒属于呼肠孤病毒科(reoviridae)轮状病毒属(ratavivus)，由澳大利亚科学家露丝·毕夏普(ruth bishop)等于1973年首先从腹泻患者的十二指肠上皮细胞中发现。
2、轮状病毒病毒体直径60～80nm，呈球形，核心为分阶段双股rna，外披两层衣壳，无包膜。电镜下观察，病毒的内衣壳由22～24个辐射状结构的亚单位附着在病毒核心上，向上伸出与衣壳汇合形成车轮状，故称轮状病毒。轮状病毒基因组由11个不连续的双股rna基因片段组成，每个rna片段编码一种蛋白质(vp1～vp4，vp6，vp7，nsp1～nsp5)。依据vp6抗原性的差异可将轮状病毒分成a～g组，感染人类的主要是a组。轮状病毒在人群中具有较高的感染率，尤其是在婴幼儿群体中，是引起急性胃肠炎的主要病原之一。此外，依据vp7和vp4的不同，轮状病毒可分为多个血清型，如目前我国流行的a组轮状病毒为g9p[8]型。
3、轮状病毒的定量检测是急性胃肠炎诊断和治疗过程中的重要手段。前期已有研究者开发了针对轮状病毒的免疫检测方法(elisa等)，近年来，基于pcr技术的定量测量方法快速发展，被用于轮状病毒的核酸检测。荧光定量pcr(qpcr)方法的定量结果应用较广泛，然而qpcr依赖标准曲线进行定量分析，结果的准确性受到标准曲线的影响。
4、cn108085411a公开了一种a群轮状病毒核酸检测标准物质及其制
5、cn112359022a公开了一种检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法，其标准物质中包括蛋白包裹rna的假病毒颗粒；该假病毒标准物质的制备方法，包括以下步骤：1)合成目标核酸序列；2)利用同源重组的方法，将上述克隆获得的基因连接到慢病毒表达载体，获得重组表达质粒；3)分别将获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和假病毒包膜质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增，并分别提取相应的质粒；4)将上一步获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和包膜质粒共同转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了目标rna的假病毒颗粒；5)收集上一步的细胞培养液上清，离心过滤后获得假病毒颗粒的粗产物。但是，该制备方法同样不适用于制备g9p8轮状病毒假病毒标准物质，原因在于：1)轮状病毒采用双重命名体系，即明确以vp7和vp4两种蛋白的差异共同决定病毒的分型，新冠病毒至今未明确以蛋白或编码基因的差异作为分型的依据；2)该专利中包括o基因、n基因和e基因的片段，明显限定了此种标准物质的使用范围，且与实际检测过程存在一定的差距；3)三种基因rna的含量比例未进行说明。
6、综上分析，目前在研究轮状病毒标准物质的过程中，主要存在两个方面的局限性：
7、(1)大部分标准物质为rna形式，无法模拟病毒的完整结构，无法为实际检测过程中核酸提取过程提供质控；(2)在以vp7和vp4两种结构蛋白差异性作为双重命名系统的情况下，通常需要同时针对vp7和vp4的rna进行检测和分析，现有的的标准物质基本是以vp7rna为目标序列，不能完整包含vp7和vp4 rna序列，无法满足轮状病毒现行双重命名系统的需要，不能提供准确的量值，大大影响了实际检测的准确性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种g9p8轮状病毒假病毒标准物质及其制备方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
3、一种g9p8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)g9p8轮状病毒假病毒颗粒的制备
5、1)慢病毒载体构建
6、所述慢病毒载体包含vp4和vp7的编码基因，分别为genbank:mh182439.1和genbank:mh182443.1；其中，vp4基因序列位于vp7基因序列的n端；
7、2)将293a细胞接种于6孔板，放置于37℃，5％的co2培养箱中培养至细胞覆盖培养皿80％-90％；
8、3)a液：将构建的含vp4和vp7的编码基因的慢病毒载体溶于500μl dmem液体培养基中，震荡混匀；
9、4)b液：将pei溶液溶于500μl dmem液体培养基中，震荡混匀；
10、5)静置5min，将a液与b液混合均匀得c液；
11、6)将c液在37℃培养箱中避光放置15min；
12、7)将c液均匀加入细胞培养基中，轻晃摇匀；
13、8)用上述培养基给细胞换液，于co2培养箱中37℃培养4h后换液；
14、9)继续培养48h后收集细胞；
15、(2)g9p8轮状病毒假病毒颗粒的提取纯化；
16、(3)假病毒标准物质的稀释与保存；
17、(4)g9p8轮状病毒假病毒均匀性与稳定性分析；
18、(5)g9p8轮状病毒假病毒标准物质的定值与不确定度分析。
19、进一步的，所述步骤(2)具体为，
20、1)通过超声处理促进细胞破裂与假病毒释放；
21、2)利用高速离心机进行分离，去除离心后的上层清液，收集沉降部分并再次溶解；
22、3)取溶解后的样品加入超速离心管中，通过氯化铯密度梯度离心分离假病毒颗粒。
23、进一步的，所述步骤(3)具体为，
24、1)取600μl g9p8轮状病毒假病毒溶液与23400μl病毒保存液混合，将混合溶液置于4℃冰箱内充分摇晃，保证混合均匀；其中，所述病毒保存液具体为，pbs溶液中添加1％bsa、5％海藻糖、20u/ml rna酶抑制剂及5ng/ul酵母rna。
25、2)将混合均匀的假病毒溶液分装到0.5ml的冻存管中，每管120μl；
26、3)将分装的假病毒标准物质保存于-80℃冰箱。
27、进一步的，所述步骤(5)具体为，基于数字pcr技术，建立rt-dpcr定量方法；针对g基因和p基因分别设计特异性的引物和探针，序列如seq 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种G9P8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的G9P8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，
3.根据权利要求2所述的G9P8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，
4.根据权利要求3所述的G9P8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述病毒保存液具体为，PBS溶液中添加1％BSA、5％海藻糖、20U/ml RNA酶抑制剂及5ng/ul酵母RNA。
5.根据权利要求4所述的G9P8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)具体为，基于数字PCR技术，建立RT-dPCR定量方法；针对VP4和VP7的编码基因分别设计特异性的引物和探针，序列如SEQ ID NO：1-6所示；
6.根据权利要求5所述的G9P8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述不确定度包括定值方法的不确定度、均匀性引入的不确定度、稳定性引入的不确定度、合成标准不确定度、扩展不确定度。
7.权利
8.权利要求7所述G9P8轮状病毒假病毒标准物质在G9P8轮状病毒检测试剂盒的评价、对测量平台和测量方法提供质量控制中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种g9p8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的g9p8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，
3.根据权利要求2所述的g9p8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，
4.根据权利要求3所述的g9p8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在于：所述病毒保存液具体为，pbs溶液中添加1％bsa、5％海藻糖、20u/ml rna酶抑制剂及5ng/ul酵母rna。
5.根据权利要求4所述的g9p8轮状病毒假病毒标准物质的制备方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨佳怡，沈海滢，刘明伟，刘争，高运华，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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