【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物石蜡切片，尤其涉及一种澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法。
技术介绍
1、澳洲坚果(macadamia integrifolia)属山龙眼科(proteaceae)澳洲坚果属(macadamia)常绿乔木，其种仁富含不饱和脂肪酸，蛋白质，糖等，营养价值高，风味独特，在我国作为经济林的栽培面积占世界种植面积的60％。虽然我国种植面积较大，但是产量占比却只有14％，对于丰产栽培技术有急迫需求。
2、芽是植物生长发育的基本单位，其内部结构变化需要通过解剖学方法来观察，石蜡切片是运用最为广泛，也是成本最低的方法。一般的石蜡切片技术包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片和观察等步骤。澳洲坚果叶芽着生在叶腋处，外被大量灰褐色绒毛，质地坚硬，切片过程中试剂很难浸润材料，以至于常规的石蜡切片技术很难得到完整的澳洲坚果石蜡切片图片。
3、现有技术中对于这种有多毛特性的植物材料，研究者们在石蜡切片脱水步骤前添加了软化这个步骤：
4、比较常用的有在水中煮沸30min(参见帅焕丽,杨途熙,魏安智,et al.杏花芽石蜡切片方法的改良[j].果树学报,2011,28(3):536-539；陈利娜,薛辉,李好先,等.石榴花芽石蜡切片制作方法的改良[j].安徽农业科学,2017,45(2):4)；
5、体积分数20％的盐酸中浸泡24h(参见张乐道,曹世英,王国泽,等.石蜡切片改良技术及其在怀山药干燥中的应用[j].食品与发酵工业,2023,49(1):238-243；李泽华.费约果花芽
6、乙醇：甘油(1:1)浸泡法(徐军亮,章异平,苏维,等.一种树木茎干组织的石蜡切片方法:cn 201610965041[p].cn 106525530 a[2024-05-30].)等。
7、但是上述方法的制备的切片均不完整，如何对石蜡切片的制备方法进一步优化，得到完整清晰的澳洲坚果叶芽显微结构图片，是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，解决了澳洲坚果叶芽因坚硬和绒毛多的特性而很难得到完整石蜡切片的问题，获得的石蜡切片清晰度高，完整度高，染色效果好。
2、本专利技术所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)固定：将芽体整个浸入faa溶液中24h以上；
4、(2)软化：将固定后的材料转移到25～35％的盐酸溶液中软化2～4d；
5、(3)脱水：软化过的芽用蒸馏水冲洗后，置于乙醇中浸泡脱水；
6、(4)透明：脱水过后，将芽依次在二甲苯-无水乙醇混合溶液、纯二甲苯、纯二甲苯中浸泡至透明；
7、(5)浸蜡：将透明的芽置于碎蜡溶液中，于50～60℃烘箱放置30min，取出芽置于纯石蜡中，放置于50～60℃烘箱加热3d，得到浸蜡后的芽体；
8、(6)切片：在包埋盒中加入新蜡，放入浸蜡后的芽体，常温凝固过夜，修整蜡块至表面平整后，用切片机切片，将完整的切片放置于装有40～45℃蒸馏水的恒温水浴锅中展平；
9、(7)贴片和展片：蘸取少量的粘片剂均匀涂抹在载玻片上，将切片于载玻片上展平、烘片2～3h；
10、(8)染色，得到所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片。
11、优选的，步骤(1)所述的faa溶液为叶芽体积的10倍以上。
12、优选的，步骤(3)所述的脱水，是将软化过的芽用蒸馏水冲洗后，依次置于浓度为70％、85％、95％、100％、100％的乙醇中浸泡各20min。
13、优选的，步骤(4)所述的二甲苯-无水乙醇混合溶液中二甲苯与无水乙醇的体积比为1:1。
14、优选的，步骤(5)所述的碎蜡溶液是在二甲苯中加入碎蜡至饱和制备得到的；步骤(5)所述的纯石蜡的加热期间更换3～4次纯石蜡。
15、优选的，步骤(6)所述的切片厚度为10～20μm。
16、优选的，步骤(6)所述的展平过程光面朝下。
17、优选的，步骤(7)所述的粘片剂由甘油和蛋清按照质量比1:1组成；所述烘片的温度为40～45℃。
18、优选的，步骤(8)所述的染色，包括以下步骤：
19、(a)将含有叶芽的载玻片置于二甲苯中两次，各15min；
20、(b)置于二甲苯与无水乙醇体积比为1:1的混合溶液中1～2min；
21、(c)然后依次置于无水乙醇、85％乙醇溶液、70％乙醇溶液、50％乙醇溶液、蒸馏水中，各1-2min；
22、(d)取出后采用质量浓度0.5％的甲苯胺蓝溶液染色10s，采用蒸馏水轻轻除去多余染色剂；
23、(e)依次转移至50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、85％乙醇溶液、无水乙醇、二甲苯和无水乙醇体积比为1:1的混合溶液、二甲苯中，各1-2min，滴加少量中性树胶，盖上盖玻片，得到所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片。
24、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
25、本专利技术提供了一种澳洲坚果芽体的石蜡切片制作方法，对固定后的澳洲坚果芽体进行了浓盐酸软化操作，通过盐酸的软化和轻微腐蚀，能够溶解部分芽体表面的绒毛，降低其隔水性能，软化表皮组织，让乙醇、二甲苯和染色剂等溶液以及石蜡能够更好地渗透进芽的内部，和石蜡更好地融合，从而提高切片的完整性，染色后色彩丰富。
26、本专利技术采用盐酸软化步骤，并对软化浓度和软化时间进行选择，其直接影响切片的完整性，本专利技术的上述方案能够得到完整且清晰的切片，在多毛特性的材料上具有很大的应用潜力。
27、本专利技术的方法能得到完整且连续的蜡带，厚度在15-20μm间，完整度在73.3％以上，能够满足解剖结构分析的需要，切片中间组织完整，染色后组织结构清晰，颜色艳丽。且该方法不仅能用于制备澳洲坚果叶芽石蜡切片，也能用于制备澳洲坚果枝条的石蜡切片。
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1.一种澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的FAA溶液为叶芽体积的10倍以上。
3.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的脱水，是将软化过的芽用蒸馏水冲洗后，依次置于浓度为70％、85％、95％、100％、100％的乙醇中浸泡各20min。
4.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的二甲苯-无水乙醇混合溶液中二甲苯与无水乙醇的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的碎蜡溶液是在二甲苯中加入碎蜡至饱和制备得到的；步骤(5)所述的纯石蜡的加热期间更换3～4次纯石蜡。
6.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述的切片厚度为10～20μm。
7.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述的粘片
8.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(8)所述的染色，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的faa溶液为叶芽体积的10倍以上。
3.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的脱水，是将软化过的芽用蒸馏水冲洗后，依次置于浓度为70％、85％、95％、100％、100％的乙醇中浸泡各20min。
4.根据权利要求1所述的澳洲坚果叶芽石蜡切片的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的二甲苯-无水乙醇混合溶液中二甲苯与无水乙醇的体积比为1:1。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王照，宋喜梅，曾辉，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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