【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种非酒精性脂肪肝类器官模型及其制备方法和应用。
技术介绍
1、非酒精性脂肪性肝病(nafld)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝（sfl）、非酒精性脂肪性肝炎（nash）及其相关肝硬化。nafld是一种潜在的严重疾病，主要原因是肝脏中脂肪的异常堆积，导致肝脏脂肪变性。这种情况通常伴有代谢异常，包括肥胖、糖尿病和高脂血症，它们可能共同作用，导致疾病进一步进展，可发展为非酒精性脂肪性肝炎（nash），如果治疗不及时，甚至发展为肝纤维化、肝硬化以及肝癌。
2、nafld的药物治疗过程，还需要通过改变生活方式进行干预，包括低热量饮食、减肥和运动。目前的研究重点大多放在晚期和临床nash阶段，而针对早期疾病及其发病机制的研究较少。因此，对非酒精性脂肪肝的第一阶段——脂肪变性阶段进行有效的研究在最小化肝损害和疾病进展方面至关重要。
3、类器官是具有特定器官关键结构和功能特性的三维(3d)细胞培养物。相比人源细胞系和动物模型，类器官再现了原代组织的三维结构，更接近于体内组织的结构和功能特性，能模拟体内器官的结构和功能特征，被广泛用于疾病建模、药物筛选和药物安全性评价。
4、原代肝细胞现已成为肝脏类器官的主要来源之一。越来越多的研究表明，成熟的肝细胞在特定环境中仍然具有干性潜力和增殖能力。组织来源的肝脏类器官的高遗传稳定性以及与器官的高度相似性使其成为
5、中国专利公开号cn116426461a公开了一种体外脂肪肝类器官模型及其制备方法，具体包括将棕榈酸(1m)和油酸(2m)溶解在dmso中以制备游离脂肪酸(ffas)储备溶液，-20℃储存；然后，向dmem完全培养基中添加牛血清白蛋白(终浓度为1％w/v)、游离脂肪酸储备溶液(终浓度为900μm)和葡萄糖(终浓度为55mm)，将培养基在37℃下水浴加热2小时，使游离脂肪酸与白蛋白结合；最后，调整培养基中dmso浓度，使含有不同浓度游离脂肪酸的脂肪肝类器官诱导培养基最终的dmso浓度为0.045％。但是该模型的制备过程中需要采用dmso有毒溶剂，其配制游离脂肪酸的方法加入培养基后易析出，导致模型构建的效果不稳定，且游离脂肪酸储备溶液的用量较高。
6、因此，利用开发一种能解决上述技术问题的非酒精性脂肪肝类器官模型及其制备方法和应用是非常必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足而提供一种无毒、稳定性高、原料用量低的非酒精性脂肪肝类器官模型及其制备方法和应用。
2、本专利技术基于肝脏类器官，尤其是鼠源肝脏类器官，聚焦非酒精性脂肪肝（nafld）的第一阶段——脂肪变性阶段，通过游离脂肪酸处理，构建非酒精性脂肪肝类器官模型，旨在更好地模拟肝脏的生理行为和病理状态。
3、本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：
4、一种非酒精性脂肪肝类器官模型的制备方法，包括使肝类器官与包含游离脂肪酸（ffa）的溶液在培养基中接触的步骤；所述游离脂肪酸在培养基中的浓度至少为500μm，优选500μm；
5、所述包含游离脂肪酸的溶液的配制方法包括如下步骤：
6、（1）取油酸和棕榈酸，用100%乙醇配制成溶液a；
7、（2）取含牛血清白蛋白的缓冲溶液与溶液a混合，直至溶液澄清透明，备用。
8、在本专利技术的一些实施例中，所述游离脂肪酸由油酸和棕榈酸组成，两者摩尔比为1:1。
9、在本专利技术的一些实施例中，所述游离脂肪酸在培养基中的浓度为500μm。
10、在本专利技术的一些实施例中，所述培养基由advanced dmem/f12培养基中添加10±1mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1%谷氨酰胺（体积百分数）、1%青霉素-链霉素（体积百分数）、1:50b27（指b27和培养基的体积比为1:50，即体积百分数为2%）、1.25±0.1 mm n-乙酰半胱氨酸、250±25ng/ml r-spondin-1、50±5ng/ml egf、100±10ng/ml fgf10、50±5ng/ml hgf、10±1 nm胃泌素、10±1 mm烟酰胺、3±0.3 μm chir99021、1±0.1 μm a83-01和10±1 mmrock 抑制剂 y-27632制成。
11、在本专利技术优选的一些实施例中，所述培养基由advanced dmem/f12培养基中添加10 mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1%谷氨酰胺（体积百分数）、1%青霉素-链霉素（体积百分数）、1:50 b27（指b27和培养基的体积比为1:50，即体积百分数为2%）、1.25 mm n-乙酰半胱氨酸、250ng/ml r-spondin-1、50ng/ml egf、100ng/ml fgf10、50ng/ml hgf、10 nm胃泌素、10mm烟酰胺、3 μm chir99021、1 μm a83-01和10 mm rock 抑制剂 y-27632制成。
12、在本专利技术的一些实施例中，所述接触的时间为5-7天。
13、在本专利技术的一些实施例中，在所述接触的步骤之前，将肝类器官分散在基质胶中，以促进游离脂肪酸的渗透。
14、在本专利技术优选的一些实施例中，所述基质胶为matrigel基质胶（康宁，货号354248），其为分离自engelbreth-holm-swarm (ehs) 小鼠肉瘤的可溶性基底膜提取物，该肿瘤富含ecm蛋白，如层粘连蛋白 (主要成分)、iv型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白和多种生长因子。
15、在本专利技术的一些实施例中，步骤（1）中先采用100%乙醇配制油酸母液和棕榈酸母液，再混合得到溶液a，所述油酸母液的浓度为200±20mm，所述棕榈酸母液的浓度为200±20mm。
16、本专利技术步骤（2）中取含牛血清白蛋白的缓冲溶液与溶液a混合，主要是将牛血清白蛋白与游离脂肪酸ffa（油酸、棕榈酸）进行偶联。
17、在本专利技术的一些实施例中，步骤（2）中取含牛血清白蛋白的缓冲溶液与溶液a混合后在55±5℃水浴中静置15±5min。
18、在本专利技术的一些实施例中，步骤（2）中所述含牛血清白蛋白的缓冲溶液为含10±1%牛血清白蛋白的pbs溶液。本专利技术所述含牛血清白蛋白的缓冲溶液不含游离脂肪酸。
19、在本专利技术的一些实施例中，步骤（2）备用的储存条件为：浓度为8 mm，-20℃保存。
20、本专利技术还涉及上述的制备方法制备得到的非酒精性脂肪肝类器官模型。
21、本专利技术还涉及上述的非酒精性脂肪肝类器官模型在药物筛选中的应用。
22、所述药物包括但不限于治疗单纯性脂肪肝（本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非酒精性脂肪肝类器官模型的制备方法，其特征在于，包括使肝类器官与包含游离脂肪酸的溶液在培养基中接触的步骤；所述游离脂肪酸在培养基中的浓度至少为500μM；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养基由Advanced DMEM/F12培养基中添加10±1 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、2% B27 、1.25±0.1 mM N-乙酰半胱氨酸、250±25ng/mL R-spondin-1、50±5ng/mL EGF、100±10ng/mLFGF10、50±5ng/mL HGF、10±1 nM胃泌素、10±1 mM烟酰胺、3±0.3 μM CHIR99021、1±0.1μM A83-01和10±1 mM ROCK 抑制剂 Y-27632制成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养基由Advanced DMEM/F12培养基中添加10 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、2% B27 、1.25 mMN-乙酰半胱氨酸、250ng/mL R-spondin-1、50
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中取含牛血清白蛋白的缓冲溶液与溶液A混合后在55±5℃水浴中静置15±5min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中先采用100%乙醇配制油酸母液和棕榈酸母液，再混合得到溶液A，所述油酸母液的浓度为200±20mM，所述棕榈酸母液的浓度为200±20mM。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述含牛血清白蛋白的缓冲溶液为含10±1%牛血清白蛋白的PBS溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述游离脂肪酸由油酸和棕榈酸组成，两者摩尔比为1:1；所述接触的时间为5-7天。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述接触的步骤之前，将肝类器官分散在基质胶中。
9.根据权利要求1-8任一所述的制备方法制备得到的非酒精性脂肪肝类器官模型。
10.权利要求9所述的非酒精性脂肪肝类器官模型在药物筛选中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种非酒精性脂肪肝类器官模型的制备方法，其特征在于，包括使肝类器官与包含游离脂肪酸的溶液在培养基中接触的步骤；所述游离脂肪酸在培养基中的浓度至少为500μm；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养基由advanced dmem/f12培养基中添加10±1 mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、2% b27 、1.25±0.1 mm n-乙酰半胱氨酸、250±25ng/ml r-spondin-1、50±5ng/ml egf、100±10ng/mlfgf10、50±5ng/ml hgf、10±1 nm胃泌素、10±1 mm烟酰胺、3±0.3 μm chir99021、1±0.1μm a83-01和10±1 mm rock 抑制剂 y-27632制成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养基由advanced dmem/f12培养基中添加10 mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、2% b27 、1.25 mmn-乙酰半胱氨酸、250ng/ml r-spondin-1、50ng/ml egf、100ng/ml fgf10、50ng/ml hg...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文君，樊启贵，孙登龙，李颖萌，詹扬，王晨萱，袁蓉，
申请(专利权)人：江中药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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