一种耳聋易感基因筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种遗传性耳聋易感基因筛查试剂盒，该试剂盒以１２ｓ　ｒＲＮＡ基因１４９４位点的Ｃ→Ｔ突变、１２ｓ　ｒＲＮＡ基因１５５５位点的Ａ→Ｇ突变、ＳＬＣ２６Ａ４基因ＩＶＳ７（－２）位点的Ａ→Ｇ突变、ＧＪＢ２基因２３５位点Ｃ（±）为检测对象，根据四引物扩增受阻突变体系ＰＣＲ技术原理，针对每个待测位点分别设计和优化出一套特异引物，并将成套引物置于同一个反应管中进行扩增，对四个反应管进行一次多重ＰＣＲ扩增和一次凝胶电泳，即可同时获得四个位点的基因型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测
，特别涉及一种对耳聋易感基因进行筛查的 试剂盒。
技术介绍
人体疾病的控制与预防，关键是预知疾病，即知道疾病发病倾向，然后才 能进行针对性的保健。目前疾病的检查分5个等级：组织器官水平、临床前、 细胞水平、蛋白质水平、基因水平(分子水平)，由此看出，基因检测是最早的 预警，也是最精确最高水平的诊断。基因检测是通过对受检者基因编码序列的 测定和定位分析，精确定格相关器官的生理健康状态，探知现在，预示未来。 国际标准化操作，结果可随时与国际接轨。它能使每个受检者有意识、有针对 性地捍卫现时健康，调节与控制易患疾病因素的“适时”表达。 人类目前已经发现的单基因遗传疾病有6000多种，抽取羊水细胞，甚至 从母体血中都可获得胎儿细胞。检查这些细胞的该基因是否有缺陷，就能确定 胎儿是否从亲体获得遗传性疾病，如是，则可立即终止妊娠。当前更先进的方 法是进行体外受精，然后取早期胚胎细胞进行基因检查，选取正常的早期胚胎 植入母体妊娠。通过对病原体DNA的检查，可以使传染病的检出率、检出速 度大大提高。例如对结核杆菌感染的诊断，以前要靠痰、粪便或血液培养，耗 时两周以上，现在用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在1小时内 就能得出结果。基因检查对非感染性疾病的诊断也有帮助。目前基因诊断已扩 大到疾病易感性基因的检查。有些基因改变本身并不致病，但这些基因改变的 个体易受某些环境因素的作用而得某种疾病，例如现在发现染色体上的BCR1 基因发生突变的女性易患乳腺癌，据此可筛选出乳腺癌易感人群，加强预防。 现在已发现糖尿病、骨质疏松、高血压、白血病等多种疾病的易感基因。 在各种疾病易感基因中，聋病易感基因已受到越来越多的关注。根据国家 卫生部和中国残联的统计资料，我国目前有1.2亿人存在听力障碍，其中听力 -->语言残疾者达2780万人，并以每年3万聋儿的速度在增长，其中一半以上患 者的病因与遗传因素有关。发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋 患者中约占80％，因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学 的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基 因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的 数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异 常中的重要性。 在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因， 在先天性重度耳聋患者中约占30-50％。目前，在该基因已经发现了100多种 突变类型，然而，不同种族GJB2基因常见的突变形式不同。在中国常见的突 变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74.14％，约22.2％的中国耳聋 患者与该突变有关。该基因突变者多数表现为先天性重度耳聋，然而相当一部 分GJB2基因突变者在出生时其听力并无异常，在听力筛查中被判定为“通过”， 使得此型耳聋的发现被延迟。因此，在新生儿期对GJB2基因突变进行筛查是 早期发现潜在耳聋危机、早期预警和早期干预的重要策略。 药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A→G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏 感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10％的具有12S rRNA基 因1555A→G突变，美国语前听力损失患者中，1555A→G突变患者的发病率 约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A→G突变与15-20％的 家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙 类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超 出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊散发的耳聋患者中的检 测发现约5％的患者是由于12S rRNA基因1555A→G突变导致的，而在聋哑 学校这样一个特殊群体，则高达12％的患者是由于12S rRNA基因1555A→G 突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了12S rRNA基因 1494C→T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由 于1494C→T突变导致的。1555A→G突变和1494C→T突变者在出生时往往 听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使 用而发生听力损失的隐患。针对线粒体12SrRNA基因1555A→G突变和 -->1494C→T突变的基因检测可以揭示母系遗传的特征，并可以进行有效的预警。 对Pendred综合征病人的研究表明，在SLC26A4基因检测时常带有两个突 变位点，而61％的单纯前庭水管扩大患者仅带有单个突变，这一点提示在1.7％ 的SLC26A4基因突变携带者中，超过30％的人都可能具有发病的危险。同时 也表明，在这些单纯前庭水管扩大患者中，可能存在其他基因的突变与 SLC26A4基因的单个突变相互作用。最近的研究显示，在810名感音神经性 耳聋的患儿中，20.8％的患儿表现为前庭水管扩大并感音神经性聋，理论上讲， 这些患儿出生后即有症状，然而这些症状发现的平均年龄却为5.8岁。可以推 测，他们之中约7％的患儿表现为语前听力损失，若当时进行早期基因检测和 干预的话这些患儿会大大受益。赵亚丽等对中国西北地区101个大前庭水管综 合征的家庭中107名患者和159名重度感音神经性耳聋患者进行了系统的研 究，初步绘制了前庭水管扩大相关基因SLC26A4在中国人群的突变图谱，发 现了存在于中国人群突变热点区域为：内含子7的3’端的IVS7-2A＞G。 SLC26A4与大前庭导水管综合征密切相关，基因诊断可以对疾病进行早期的 预防和预警，有利于明确病因并可以尽可能地防止听力进行性下降。这些进展 为临床疾病的诊断提供了更为全面的手段，为病人提供了更为有效的咨询。 通过上述三个易感基因与遗传性耳聋的关系，结合当前施行的聋病治疗 策略与技术，我们可以设计一套遗传性耳聋综合防治的方案：1、如果患儿基 因诊断结果提示先天性耳聋是由于GJB2基因突变导致的，那么该患儿的耳神 经传导通路以及听觉语言中枢应该是正常的，因此在患儿早期即可进行人工耳 蜗移植，使患儿获得良好的语言发育。2、如果1555A＞G基因检查为阳性，那 么患儿的母亲家族中应该永远避免应用氨基糖甙类药物，防止药物性耳聋发 生。进行产前基因诊断，对于有生育耳聋患儿风险的夫妇意义特别重大。当他 们生育一个聋儿后，迫切想知道第二个孩子的情况，这时的基因诊断加上产前 诊断，在怀孕10周后即可确认胎儿的耳聋基因状态，从而可以提前采取干预 措本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传性耳聋易感基因筛查试剂盒，其特征在于，以１２ｓ　ｒＲＮＡ基因１４９４位点的Ｃ→Ｔ突变、１２ｓ　ｒＲＮＡ基因１５５５位点的Ａ→Ｇ突变、ＳＬＣ２６Ａ４基因ＩＶＳ７（－２）位点的Ａ→Ｇ突变、ＧＪＢ２基因２３５位点Ｃ（±）为检测对象，根据四引物扩增受阻突变体系ＰＣＲ技术原理，针对每个待测位点分别设计和优化出一套特异引物，并将成套引物置于同一个反应管中进行扩增，对四个反应管进行一次多重ＰＣＲ扩增和一次凝胶电泳，即可同时获得四个位点的基因型。

【技术特征摘要】
1、一种遗传性耳聋易感基因筛查试剂盒，其特征在于，以12s rRNA基因 1494位点的C→T突变、12s rRNA基因1555位点的A→G突变、SLC26A4 基因IVS7(-2)位点的A→G突变、GJB2基因235位点C(±)为检测对象， 根据四引物扩增受阻突变体系PCR技术原理，针对每个待测位点分别设计和 优化出一套特异引物，并将成套引物置于同一个反应管中进行扩增，对四个反 应管进行一次多重PCR扩增和一次凝胶电泳，即可同时获得四个位点的基因 型。 2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，12s rRNA基因1555位点A →G突变检测的上游外引物位于1555位点上游的第1310-1360nt区域(引物设 定名称为SEQ NO.01)，下游外引物位于1555位点下游的第1640-1690nt区域 (引物设定名称为SEQ NO.02)，对应突变基因型的内引物位于1515-1555nt 区域(引物设定名称为SEQ NO.03)，对应正常基因型的内引物位于 1555-1595nt区域(引物设定名称为SEQ NO.04)。 3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，12s rRNA基因1494位点 C→T突变检测的上游外引物位于1494位点上游的第1200-1250nt区域(引物 设定名称为SEQ NO.05)，下游外引物位于1494位点下游的第1640-1690nt区 域(引物设定名称为SEQ NO.06)，对应突变基因型的内引物位于1450-1494nt 区域(引物设定名称为SEQ NO.07)，对应正常基因型的内引物位于 1494-1534nt区域(引物设定名称为SEQ NO.08)。 4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SLC26A4基因IVS7(-2) 位点A→G突变检测的上游外引物位于IVS7(-2)位点上游的IVS7的第(-360) 一(-310)nt区域(引物设定名称为SEQ NO.09)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋菊，魏宏泉，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]