【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及拉曼光谱，尤其涉及一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法。
技术介绍
1、肺癌是发病率和致死率最高的一种恶性肿瘤，其早期诊断的5年生存率可达60％以上，在肺癌治疗过程中，患者往往因化疗导致恶心、呕叶及骨髓抑制而停止治疗，所以，近年来，免疫治疗在临床上广泛应用，不仅对肿瘤细胞起杀伤作用，而且能够维持正常细胞增强患者免疫功能，减少不良反应的发生。同时治疗追踪也能达到及时发现不良反应，第一时间准确判断的作用。
2、外泌体是一类纳米级别的胞外囊泡，直径大约在30-150nm，广泛分布于血液、尿液、唾液、脑脊液和乳汁等体液中，恶性肿瘤微环境来源的外泌体带有来自母体肿瘤细胞的蛋白和核酸等物质，正在逐渐成为一种能用于肺癌早期诊断和治疗追踪的生物标志物。
3、外泌体携带的pd-l1蛋白参与诱导免疫逃逸以促进肿瘤进展，还可以通过直接与抗pd-l1抗体结合介导免疫治疗，并且研究表明，快速、简单、准确的外泌体pd-l1检测能提供肺癌病人精准的治疗追踪和治疗指导。
4、到目前为止，各种技术已被用于研究这些外泌体表面蛋白质标记物，如蛋白质免疫印迹(wb)、酶联免疫吸附测定(el i sa)、表面等离子体共振(spr)等，但它们都存在着一些局限性，如：检测方法操作复杂、灵敏度及特异度较差、难以实现多元检测、不适于进行大样本检测及成本较高等，因此难以适应肺癌临床诊疗的需求。
5、拉曼光谱基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动“指纹”信息，能
6、为使sers检测更加灵敏，现如今有许多增强策略，如采用具有“热点”结构的活性基底和酶、核酸等生物分子实现被测物sers信号增强，但这些策略都是基于单一的增强步骤，将目标识别事件转换为信号读出，在一定程度上限制了sers检测的高灵敏度，越来越多研究表明，tsa/psa是更好的提高sers检测灵敏度的方法，tsa/psa是一种基于hrp的催化活性对靶蛋白进行高密度原位标记的酶学检测方法，原理为tyramine/styramine的过氧化物酶反应产生的大量酶促产物与目标蛋白的酪氨酸残基共价结合，从而使目标蛋白形成高密度拉曼信号区域，实现检测信号放大，因此，利用tsa/psa—sers检测外泌体pd-l1蛋白有助于肺癌的诊断和精准治疗的指导，解决肺癌早期诊断率低、复发率高、预后不理想、耐药性等问题。
7、因此，有必要提供一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法解决上述技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法，解决了上述的技术背景问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法，包括以下步骤；
3、步骤一、外泌体来源pd-l1蛋白与抗体的特异性结合；
4、外泌体溶液稀释到适当浓度后，将偶联hrp的抗pd-l1抗体滴加到外泌体溶液中，孵育30min；
5、步骤二、tsa/psa反应；
6、将过氧化氢(h2o2)修饰后的偶联拉曼探针的纳米金球(aunp@dye-tyramine/aunp@dye-styramine)溶液加入到外泌体溶液中，孵育10min；
7、步骤三、基于fe3o4@t io2磁珠的外泌体富集；
8、将外泌体溶液与fe3o4@t io2磁珠一起孵育，通过磁铁使fe3o4@t io2-外泌体复合物沉淀，去除上清液；
9、步骤四、拉曼信号的采集；
10、将fe3o4@t io2-外泌体复合物用pbst溶液洗涤两次后，通过拉曼检测系统采集拉曼信号。
11、进一步地，步骤一中与hrp偶联的抗体通过以下步骤制备:
12、1)抗体的处理：
13、调整抗体浓度，并且使用碳酸盐缓冲液稀释。
14、2)hrp标记抗体：
15、a.称取适量hrp，用磷酸缓冲液phosphate buffer(pb)溶解，并加入甲醛水溶液，充分混匀5min后加入na l o4，再次混匀后于冰箱内，温度为3-5°c，冷藏30min，再加入乙二醇水溶液，30min后加入冰冷无水乙醇，充分混匀；
16、b.离心，去除上液，沉淀中再加入乙醇混匀后，离心去除乙醇溶液；
17、c.加入碳酸盐缓冲液溶解沉淀后，加入抗体溶液，于4℃冰箱内放置3-5h，随后加入新鲜配制的kbh4水溶液，于4℃冰箱内放置4-16h，最后加入kh2po4保存。
18、进一步地，步骤二中纳米金球溶液的制备具体步骤为；
19、1)aunp的合成；
20、将hauc l 4溶液加热至沸点，连续搅拌，将na3c6h5o7·2h2o溶液快速加入上述混合物中，煮沸，颜色变成酒红色表示aunp的形成；
21、2)探针标记aunp；
22、将带有巯基的二炔拉曼探针加入aunp溶液中，搅拌12h，再将aunp溶液离心两次；
23、3)aunp与tyramine/styramine偶联；
24、将nhs、edc和tyramine/styramine溶液加入aunp溶液中，搅拌和离心后，用去离子水重悬沉淀。
25、进一步地，所述步骤二中fe3o4@t io2磁珠的合成方法具体为；
26、1)将fe3o4和氨水溶解在乙醇中，搅拌15min，在持续搅拌下，逐滴加入tbot溶于乙醇中，在连续机械搅拌下继续反应24h；
27、将所得产物分离收集，并且分别用乙醇和水洗涤3次，随后在真空中干燥12h；
28、2)将得到的fe3o4@t io2磁珠和nh4f与乙醇和水混合，机械搅拌60min后，在聚四氟乙烯反应釜中水热处理24h，再用超纯水洗涤3次，去除离子杂质，干燥过夜；
29、3)将磁珠分散在乙醇和aptms中，重新搅拌4h，并将所得aptms改性的磁珠用乙醇洗涤3次，最后在乙醇中重新分散。
30、进一步地，所述fe3o4的合成方法具体为；
31、1)将fec l 3·6h2o、na3c6h5o7·2h2o和乙酸钠溶解在乙二醇中，然后将混合物转移并密封到聚四氟乙烯反应釜中反应10h；
32、2)将得到的黑色产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于外泌体来源PD-L1蛋白高灵敏检测的酶放大SERS检测方法，其特征在于，包括以下步骤；
2.根据权利要求1所述的一种用于外泌体来源PD-L1蛋白高灵敏检测的酶放大SERS检测方法，其特征在于，步骤一中与HRP偶联的抗体通过以下步骤制备:
3.根据权利要求1所述的一种用于外泌体来源PD-L1蛋白高灵敏检测的酶放大SERS检测方法，其特征在于，步骤二中纳米金球溶液的制备具体步骤为；
4.根据权利要求1所述的一种用于外泌体来源PD-L1蛋白高灵敏检测的酶放大SERS检测方法，其特征在于，所述步骤二中Fe3O4@TiO2磁珠的合成方法具体为；
5.根据权利要求4所述的一种用于外泌体来源PD-L1蛋白高灵敏检测的酶放大SERS检测方法，其特征在于，所述Fe3O4的合成方法具体为；
6.根据权利要求1所述的一种用于外泌体来源PD-L1蛋白高灵敏检测的酶放大SERS检测方法，其特征在于，所用抗原为PD-L1蛋白，所用抗体为Anti-PD-L1 antibody。
【技术特征摘要】
1.一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法，其特征在于，包括以下步骤；
2.根据权利要求1所述的一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法，其特征在于，步骤一中与hrp偶联的抗体通过以下步骤制备:
3.根据权利要求1所述的一种用于外泌体来源pd-l1蛋白高灵敏检测的酶放大sers检测方法，其特征在于，步骤二中纳米金球溶液的制备具体步骤为；
4.根据权利要求1所述的一种用于外泌...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄静，鄞缨欢，刘峻坤，潘春玲，刘晓丽，杜阳阳，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。