【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种以ypt1基因为特异性靶标在检测多变疫腐霉中的其应用。
技术介绍
1、多变疫腐霉(phytopythium mercuriale)属于茸鞭生物界(straminipila)，卵菌门(oomycota)，卵菌纲(oomycetes)，霜霉目(peronosporales)，腐霉科(pythiaceae)，疫腐霉属(phytopythium)，是一种重要的植物病原菌，能侵染多种经济作物和果树，如大豆、草莓、西红柿、甜菜、向日葵、柑橘、苹果树和桃树等，世界广布，寄主范围广泛，引起植物根腐病，在受侵染植物生产中造成较重的经济损失。多变疫腐霉在室温下生长较快，最低生长温度为4℃，最适宜生长温度为25–30℃，最高生长温度为38℃。形态特征为菌丝无隔，可达6.0μm宽，孢子囊近球形，具乳突。卵孢子光滑，球形，壁薄，无藏卵器。多变疫腐霉形态上极易与疫霉和腐霉混淆，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将多变疫腐霉与相近种区分开。
2、目前，针对此类卵菌的检测技术较少，通常采用传统的形态特征鉴定方法，主要依据形态学特征、致病性测生理生化特征等进行鉴定。传统方法在卵菌的检测中发挥了重要作用，但是耗时耗力，并且需要专业的卵菌分离技术和分类鉴定知识。随着核酸相关的鉴定方法的发展，pcr技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测时间仍然较长，依赖精密的温度循环装置，不能满足快速检测的需求，不适宜在基层环境中使用推广。
3、环介导等温扩增技术(loop-mediated i
4、靶标基因的选择是lamp检测的重要因素之一，目前lamp检测设计的引物的来源主要是转录间隔区(its)，但是没有足够多的位点来区分相似种，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供了一种以三磷酸鸟苷结合蛋白(ypt1)基因为特异性靶标在检测多变疫腐霉中的应用。本专利技术的第二目的是提供了一种以ypt1基因为特异性靶标检测多变疫腐霉的lamp引物组合物及其应用。本专利技术的第三目的是提供了一种检测多变疫腐霉的lamp方法。
2、技术方案：本专利技术的一种以ypt1基因为特异性靶标在检测多变疫腐霉中的应用，所述特异性检测靶标ypt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术的一种以ypt1基因为特异性靶标检测多变疫腐霉的lamp引物组合物，所述引物组合物包括：如seq id no.2所示的正向内引物fip，如seq id no.3所示的反向内引物bip，如seq id no.4所示的正向外引物f3，如seq id no.5所示的反向外引物b3，如seq idno.6所示的反向环引物lb。
4、由于传统多变疫腐霉检测方法只是依据形态特征来进行鉴定，而多变疫腐霉的生长受温度影响形态不稳定，同时受到相近种的影响，很难准确鉴定出来。而本专利技术根据多变疫腐霉的ypt1基因序列，利用blast软件将多变疫腐霉的基因组序列与其它疫腐霉的基因组序列进行比较，选取了多变疫腐霉特有的一段ypt1基因序列并设计特异性的lamp引物。在lamp设计引物中，通常引物的靶区域长度是200-400bp左右。lamp引物设计时靶标区域尤其重要，直接影响着引物的特异性和灵敏度。lamp反应通过4条引物(fip、bip、f3、b3)特异性识别靶序列上的6个独立区域(表1)，其特异性比较高。此外，反向环引物lb能够提高反应速率，和其它四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本专利技术能快速的进行多变疫腐霉检测。lamp反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。
5、本专利技术的上述lamp引物组合物在制备试剂盒中的应用。
6、本专利技术的一种用于检测多变疫腐霉的lamp试剂盒，所述试剂盒中包含上述的lamp引物组合物。
7、进一步地，所述试剂盒还包含10×thermopol buffer、mgso4、dntps、甜菜碱、bstdna polymerase、羟基萘酚蓝。
8、一种上述lamp引物组合物、lamp试剂盒在检测多变疫腐霉中的应用，所述的检测为非疾病诊断目的的检测。
9、本专利技术的一种检测多变疫腐霉的lamp方法，提取待检微生物dna，取dna溶液作为反应模板，以上述的引物组合物进行lamp反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若扩增产物呈天蓝色表示检测结果为阳性，则表示待检测生物中存在多变疫腐霉；若扩增产物呈紫色表示检测结果为阴性，则表示待检测生物中不存在多变疫腐霉。
10、进一步地，所述lamp反应体系为：2.5μl10×thermopol buffer，8mmol·l-1mgso4，1.2mmol·l-1dntps，内引物fip和bip各1.6μmol·l-1，外引物f3和b3各0.4μmol·l-1，0.8μmol·l-1环引物lb，0.8μmol·l-1甜菜碱，8u·μl-1bst dna polymerase，180mmol·l-1羟基萘酚蓝，2μl模板dna，灭菌水补至26μl。
11、进一步地，所述lamp反应的程序为：63℃反应扩增60min。
12、有益效果：本专利技术公开的新的靶标基因ypt1用于检测多变疫腐霉，基于该靶标基因设计的lamp引物组合物可用于快速高效检测多变疫腐霉，检测方法具有特异性强、准确度高、灵敏度好、操作简单、可肉眼观察结果的优点，当dna达到100pg·μl-1时即可鉴定出多变疫腐霉，实用性强。
13、与现有技术相比，本专利技术具有如下突出的显著优点：本专利技术公开的靶标基因ypt1用于检测柑橘褐腐疫霉，基于该靶标基因设计的lamp引物组合物可用于快速高效检测柑橘褐腐疫霉，检测方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种以Ypt1基因为特异性靶标在检测多变疫腐霉中的应用，其特征在于，所述特异性检测靶标Ypt1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种以Ypt1基因为特异性靶标检测多变疫腐霉的LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：如SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3，如SEQID NO.6所示的反向环引物LB。
3.一种权利要求2所述的以Ypt1基因为特异性靶标检测多变疫腐霉的LAMP引物组合物在制备试剂盒中的应用。
4.一种用于检测多变疫腐霉的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求2所述的LAMP引物组合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测多变疫腐霉的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含10×ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTPs、甜菜碱、Bst DNA polymerase、羟基萘酚蓝。
6.一种权利要求2所述
7.一种检测多变疫腐霉的LAMP方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检微生物DNA，取DNA溶液作为反应模板，以权利要求2所述的引物组合物进行LAMP反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若扩增产物呈天蓝色表示检测结果为阳性，则表示待检测生物中存在多变疫腐霉；若扩增产物呈紫色表示检测结果为阴性，则表示待检测生物中不存在多变疫腐霉。
8.根据权利要求7所述的多变疫腐霉的LAMP方法，其特征在于，所述LAMP反应体系为：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，8mmol·L-1MgSO4，1.2mmol·L-1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μmol·L-1，外引物F3和B3各0.4μmol·L-1，0.8μmol·L-1环引物LB，0.8μmol·L-1甜菜碱，8U·μL-1Bst DNA polymerase，180mmol·L-1羟基萘酚蓝，2μL模板DNA，灭菌水补至26μL。
9.根据权利要求7所述的多变疫腐霉的LAMP方法，其特征在于，所述LAMP反应的程序为：63℃反应扩增60min。
...【技术特征摘要】
1.一种以ypt1基因为特异性靶标在检测多变疫腐霉中的应用，其特征在于，所述特异性检测靶标ypt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种以ypt1基因为特异性靶标检测多变疫腐霉的lamp引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：如seq id no.2所示的正向内引物fip，如seq id no.3所示的反向内引物bip，如seq id no.4所示的正向外引物f3，如seq id no.5所示的反向外引物b3，如seqid no.6所示的反向环引物lb。
3.一种权利要求2所述的以ypt1基因为特异性靶标检测多变疫腐霉的lamp引物组合物在制备试剂盒中的应用。
4.一种用于检测多变疫腐霉的lamp试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求2所述的lamp引物组合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测多变疫腐霉的lamp试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含10×thermopol buffer、mgso4、dntps、甜菜碱、bst dna polymerase、羟基萘酚蓝。
6.一种权利要求2所述的lamp引物组合物、权利要求4～5任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳佳，于健，秦方，简祖平，彭金凤，孙亚亚，李松，付丹阳，黄晓潇，郑香容，吴项乾，邱秀文，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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