【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于伪结核棒状杆菌，特别涉及一种伪结核棒状杆菌基因缺失株、疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、伪结核棒状杆菌(corynebacterium pseudotuberculosis)是一种革兰氏阳性兼性胞内寄生细菌，可引起羊、牛、马等多种动物和人的发生慢性传染病，主要引发体表和内脏器官的化脓和干酪样坏死。在动物临床上，伪结核棒状杆菌对山羊和绵羊的感染最为常见。近年来，伪结核棒状杆菌在我国山羊养殖中流行非常广泛，包括陕西、四川、重庆、云南、福建等多个省市均有该病原感染的报道，发病羊脓肿样本中该病原的分离率达39.22-100％。伪结核棒状杆菌感染可造成山羊的生产性能下降，肉制品及皮张废弃，外观脓肿影响销售等，严重影响养羊业的经济效益。
2、目前我国防控伪结核棒状杆菌病的方法主要有药物治疗和手术治疗两种，但均不能从根本上限制该病原感染，其不足体现在：
3、药物防控效果不理想，其原因有：(1)药物难进入伪结核棒状杆菌引发的脓肿或干酪样坏死包囊膜中；(2)大量使用药物防控该病，容易出现病原的耐药性和药物的残留问题。手术治疗繁琐，表现在：(1)效率低，需要针对每头患病羊检查实施手术；(2)手术切开脓肿排脓过程容易污染环境；(3)只能针对体表脓肿，而对内脏器官的脓肿则无法处理。
4、接种疫苗是防控伪结核棒状杆菌感染致病最经济和高效的方法。现有的伪结核棒状杆菌疫苗主要以临床上分离得到菌株进行研究，但这些多为灭活苗或亚单位疫苗，制苗成本较高。且伪结核棒状杆菌为兼性胞内寄生菌，细胞免疫和体液免疫在应对该病
5、现有的伪结核棒状杆菌类毒素疫苗往往存在毒素类别单一，获取较困难，且需要加灭活剂灭活等问题。此外免疫原性较差，免疫保护率相对较低，通常需要注射加强针来保证持久免疫。伪结核棒状杆菌类重组蛋白疫苗存在制备工艺复杂，重组蛋白抗原稳定性较差，不易保存的问题。通常需要比对选择免疫原性较强的表位、合适的表达系统和合适的重组蛋白抗原稳定剂。
6、灭活菌体疫苗需要培养大量的细菌(一般要到达5.0×109cfu/ml)，且需要加入灭活剂灭活，且需要加强免疫，因此，存在成本高的问题。此外，灭活菌体疫苗诱导细胞免疫应答能力不强，因此免疫保护效果有限。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种伪结核棒状杆菌基因缺失株、疫苗及其制备方法，该疫苗制备方便，成本低，能有效刺激受免动物的体液免疫和细胞免疫水平，很好的抵抗伪结核棒状杆菌感染；
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、伪结核棒状杆菌基因缺失株，利用crispr/cas9基因编辑技术，以伪结核棒状杆菌宣汉株(xh02)为亲本株，敲除伪结核棒状杆菌宣汉株(xh02)的铜锌超氧化物歧化酶基因(sodc)，得到伪结核棒状杆菌基因缺失株xh02δsodc，其分类命名为伪结核棒状杆菌corynebacterium pseudotuberculosis xh02δsodc，保藏日期为2024年9月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20241890。
4、本专利技术还提供上述所述的伪结核棒状杆菌基因缺失株在制备伪结核棒状杆菌活疫苗中的应用。
5、本专利技术还提供一种伪结核棒状杆菌活疫苗，包括上述所述的伪结核棒状杆菌基因缺失株和montanide tm gel 02佐剂。
6、本专利技术还提供一种伪结核棒状杆菌活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
7、s1、将上述所述的伪结核棒状杆菌基因缺失株接种在培养基中进行培养，并添加0.05-0.3％吐温80；
8、s2、将培养物离心，弃培养上清液，采用灭菌pbs洗涤沉淀，之后采用pbs重悬菌体，并加入montanide tm gel 02佐剂，调整菌体浓度至5.0×106-1.0×107cfu/ml，得到伪结核棒状杆菌xh02δsodc活疫苗，其中佐剂浓度为10-15％。
9、优选地，步骤s1中，所述培养基为脑心浸出液肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤和lb肉汤加5％小牛血清中的任意一种。
10、优选地，步骤s1中，所述伪结核棒状杆菌基因缺失株接种在培养基中进行培养，具体包括以下步骤：培养物在37℃的条件下，200rpm恒温震荡培养24h。
11、本专利技术中的xh02δsodc减毒株培养简单，制备方便，仅需培养xh02δsodc，加入合适的佐剂和pbs涡旋混匀即可，适用于大规模生产。此外xh02δsodc接种抗原用量低(不到灭活菌体疫苗抗原的百分之一)，次数少(只需要接种一次)，因此价格相对低廉，且能有效刺激受免动物的体液免疫和细胞免疫水平，很好的抵抗伪结核棒状杆菌感染。
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1.一种伪结核棒状杆菌基因缺失株，其特征在于，所述伪结核棒状杆菌基因缺失株为XH02ΔsodC，其保藏编号为CCTCC M 20241890。
2.一种伪结核棒状杆菌基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除伪结核棒状杆菌亲本株的sodC基因，得到伪结核棒状杆菌基因缺失株。
3.权利要求1所述的伪结核棒状杆菌基因缺失株在制备伪结核棒状杆菌活疫苗中的应用。
4.一种伪结核棒状杆菌活疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述的伪结核棒状杆菌基因缺失株和Montanide TM Gel 02佐剂。
5.一种伪结核棒状杆菌活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述培养基为脑心浸出液肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤和LB肉汤加5％小牛血清中的任意一种。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述伪结核棒状杆菌基因缺失株接种在培养基中进行培养，具体包括以下步骤：培养物在37℃的条件下，200rpm恒温震
...【技术特征摘要】
1.一种伪结核棒状杆菌基因缺失株，其特征在于，所述伪结核棒状杆菌基因缺失株为xh02δsodc，其保藏编号为cctcc m 20241890。
2.一种伪结核棒状杆菌基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括：利用crispr/cas9基因编辑技术，敲除伪结核棒状杆菌亲本株的sodc基因，得到伪结核棒状杆菌基因缺失株。
3.权利要求1所述的伪结核棒状杆菌基因缺失株在制备伪结核棒状杆菌活疫苗中的应用。
4.一种伪结核棒状杆菌活疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述的伪...
【专利技术属性】
技术研发人员：周作勇，吕红，牛晓昕，彭秋月，李鑫灿，王芝英，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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