【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及哺乳动物表达载体，其包含编码作为选择标记物的细菌谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，所述多核苷酸与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性，并且涉及编码所述细菌谷氨酰胺合成酶的核酸和哺乳动物宿主细胞。特别地，细菌谷氨酰胺合成酶衍生自肠杆菌目(enterobacterales)和摩根菌科(morganellaceae)的细菌，优选地，细菌谷氨酰胺合成酶是普罗威登斯菌属(providencia)物种谷氨酰胺合成酶，任选地进一步包含在位置e130和/或f226和/或r345中的突变。本专利技术进一步涉及用于制备稳定表达感兴趣的蛋白质和/或非编码rna的哺乳动物细胞的方法，以及使用所述细菌谷氨酰胺合成酶用于在哺乳动物细胞中生产蛋白质的方法。
技术介绍
1、中国仓鼠卵巢(cho)细胞是用于生产治疗性蛋白质例如抗体的最常用哺乳动物细胞系之一。一个重要的方面是生成高产且稳定的细胞系，其在短时间段内且以高产物滴度伴随合适的产物质量表达感兴趣的蛋白质。为了产生稳定且高产的细胞系，需要选择阶段以生成由不同克隆组成的稳定的异质细胞池，在最终生产细胞系可以保存于细胞库中之前，所述异质细胞池需要进行分离且筛选。代谢选择系统例如二氢叶酸还原酶(dhfr)和谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统通常用于改善这个过程，并且更有效地生成稳定细胞系。
2、在缺乏dhfr基因的细胞系例如cho-dg44细胞中，在培养基中不存在次黄嘌呤和胸苷的情况下进行选择。另外，可以使用通过添加增加浓度的氨甲蝶呤(mtx)的扩增步骤。gs选择系统是有利的
3、谷氨酰胺合成酶(ec 6.3.1.2，也称为γ-谷氨酰:氨连接酶)催化atp依赖性的氨和谷氨酸盐的缩合，以形成谷氨酰胺。谷氨酰胺合成酶分类为三个亚组：gsi、gsii和gsiii。cho gs是ii类酶，该亚类占优势地由真核生物表达，而细菌gs蛋白通常是gsi类的成员。虽然gsi和gsii催化相同的反应，但除了构成活性位点的部分的残基之外，它们并未显示序列相似性或显示了极少的序列相似性，并且总体上相当不同。例如，细菌i型gs是12亚基复合物(eisenberg等人(2000)，biochim.biophys.acta 1477，122-145)，并且gsii已报道为形成两个或三个五元环堆叠(krajewski等人(2008)，j.mol.biol.375，217-228)。另外，细菌gs可以与彼此具有极少的序列相似性，例如凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)(cn12625930 a)或结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)(wo 2006/000045)或谷氨酸棒状杆菌(cornybacterium glutamicum)(cn 1884501 a)与居幼虫普罗威登斯菌(providencia vermicola)gs低至约50％或更低的氨基酸同一性(zuo等人，scientificreports，2018，8(1):1-8及补充材料)。
4、gs是一种普遍存在的对于氮代谢必需的酶。因此，gs已用作经由哺乳动物表达构建体引入的选择标记物。在并未表达足够水平的内源性gs的细胞系中，从细胞培养基中去除谷氨酰胺补充增加对细胞的选择压力。在内源性gs水平不足的细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系中，在不存在谷氨酰胺或缺乏谷氨酰胺补充的情况下的培养提供了足够的选择压力，以分离稳定的重组细胞系。在内源性gs充足的细胞系例如cho细胞中，需要gs抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(msx)的添加或gs敲除细胞(gs-/-或gs-/+)的生成，以允许在不存在谷氨酰胺的情况下足够的选择压力，以分离生产性细胞系。cho gs敲除细胞中的选择严格性得到极大改善，并且已进一步报道了，在弱启动子的控制下转染的gs基因的表达改善选择严格性，伴随或不伴随msx的使用。除选择严格性和生产率之外，高产克隆的蛋白质生产的稳定性已显示为关键属性。
5、另外，转染的谷氨酰胺合成酶选择标记物对选择过程和基于cho的细胞系的表型稳定性以及生产率具有重大影响。例如，cho谷氨酰胺合成酶的减弱变体的使用进一步显示了改善稳定性、选择行为和生产率(lin等人(2019)，mabs，11:5，965-976；wo 2018/093331、us20190352631、wo 2017/197098)。大多数描述的减弱变体具有在保守的底物结合残基中的突变。例如，在患有先天性gs缺乏症的两个无关婴儿中首次鉴定了含有r324c和r341c突变的两种减弱的gs突变体(lin等人(2019)，mabs，11:5，965-976)。据报道涉及谷氨酸盐结合的残基是e134、e136、e196、e203、n248、g249、h253、r299、r319、e338和r340；据报道涉及atp结合的残基是w130、a191、g192、p208、n255、s257、r262、r324和y336；并且涉及氨结合的残基是d63、s66、d162和e305(氨基酸编号参考人gs)(krajewski等人(2008)，j.mol.biol.375，217-228和wo 2018/093331)。
6、尽管具有活性位点中的突变的减弱gs变体显示了增加的选择严格性、但选择过程的持续时间和总体细胞生长特性可能是受损的，负面影响生物过程性能。选择标记物的减弱是在选择严格性、整合的拷贝数和合适的细胞培养性能(例如生长行为)之间的微妙平衡，以支持重组蛋白质的制造。因此，需要开发新型减弱的gs变体以改善细胞系开发中的哺乳动物表达载体。
7、尽管来自各个物种的细菌gs或其肽已在真核细胞例如酵母中表达，用于纯化、作为免疫原或其它原因(参见例如wo 2018/144807、wo 2006/000045 a1)，并且酵母或植物gs显示了在大肠杆菌(e.coli)中是活性的，但反之亦然(wo 2004/003175 a2和ep 0 240 792a1)，但细菌gs(gsi)假定在哺乳动物细胞中是不活跃的。更重要的是，据我们所知，细菌gs之前尚未在哺乳动物细胞中进行测试或用作选择标记物。
技术实现思路
1、本专利技术证实了，与哺乳动物谷氨酰胺合成酶基因无关的某些细菌谷氨酰胺合成酶基因可以用于生成高产且稳定的哺乳动物宿主细胞池，其表达治疗性蛋白质，特别是治疗性抗体，由于与野生型谷氨酰胺合成酶相比减弱的活性，以及在哺乳动物细胞例如cho细胞中有益的细胞培养性能，显示了更严格的选择行为。这是首次使用原核生物谷氨酰胺合成酶变体来生成稳定且高产的哺乳动物细胞池用于细胞系开发。进一步地，鉴定了居幼虫普罗威登斯菌谷氨酰胺合成酶的点突变，与野生型居幼虫普罗威登斯菌谷氨酰胺合成酶相比，其显示出延长的选择严格性和改善的抗体滴度。细菌gs选择标记物的另一个优点在于，由于与哺乳动物(例如cho)gs的低序列相似性，急剧降低了重组事件的概率，所述重组事件恢复内源性gs基因并因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种哺乳动物表达载体，其包含编码作为选择标记物的细菌谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的哺乳动物表达载体，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶衍生自肠杆菌目(Enterobacterales)和摩根菌科(Morganellaceae)的细菌，优选地其中所述细菌谷氨酰胺合成酶衍生自普罗威登斯菌属(Providencia)物种或光杆状菌属(Photorhabdus)物种，更优选地其中所述细菌谷氨酰胺合成酶是居幼虫普罗威登斯菌(Providencia vermicola)谷氨酰胺合成酶或发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)谷氨酰胺合成酶。
3.权利要求1或2的哺乳动物表达载体，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自E130X、F226Y、R345A及其组合的突变，其中X是任何氨基酸，优选地其中在氨基酸位置E130中的突变是用芳香族或疏水性氨基酸的取代，所述
4.权利要求1至3中任一项的哺乳动物表达载体，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自E130X、F226Y、R345A及其组合的突变，其中X是任何氨基酸，优选地其中在氨基酸位置E130中的突变是用芳香族或疏水性氨基酸的取代，更优选地所述芳香族或疏水性氨基酸选自Y、W、F、A、G、V、L、M和I。
5.权利要求1至4中任一项的哺乳动物表达载体，其中所述哺乳动物表达载体进一步包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码RNA的至少一种多核苷酸，优选包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码RNA的至少一种多核苷酸的表达盒。
6.根据权利要求5的哺乳动物表达载体，其中所述感兴趣的蛋白质是治疗性蛋白质，优选地选自细胞因子、激素、融合蛋白、抗体、抗体衍生分子和抗体模拟物。
7.一种核酸序列，其包含可操作地连接到哺乳动物启动子的编码细菌谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，任选地进一步包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码RNA的至少一种多核苷酸，所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
8.权利要求7的核酸序列，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自E130X、F226Y、R345A及其组合的突变，其中X是任何氨基酸，优选地其中在氨基酸位置E130中的突变是用芳香族或疏水性氨基酸的取代，更优选地所述芳香族或疏水性氨基酸选自Y、W、F、A、G、V、L、M和I。
9.一种细菌谷氨酰胺合成酶，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自E130X、F226Y、R345A及其组合的突变，其中X是任何氨基酸，优选地其中在氨基酸位置E130中的突变是用芳香族或疏水性氨基酸的取代，更优选地所述芳香族或疏水性氨基酸选自Y、W、F、A、G、V、L、M和I。
10.一种哺乳动物宿主细胞，其包含权利要求1至6中任一项的表达载体、权利要求7或8的核酸序列、或者编码权利要求9的细菌谷氨酰胺合成酶的核酸序列，优选地其中所述哺乳动物宿主细胞是(a)啮齿类动物细胞，更优选CHO细胞和/或(b)GS基因敲除细胞。
11.一种用于制备稳定表达感兴趣的蛋白质和/或非编码RNA的细胞的方法，其包括
12.权利要求11的方法，其进一步包括
13.一种生产感兴趣的蛋白质的方法，其包括
14.一种生产感兴趣的蛋白质的方法，其包括
15.权利要求10的哺乳动物宿主细胞或权利要求11至14中任一项的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是啮齿类动物细胞，更优选CHO细胞。
16.一种试剂盒，其包含权利要求1至6中任一项的表达载体和不含谷氨酰胺的细胞培养基。
17.细菌谷氨酰胺合成酶作为哺乳动物细胞中的选择标记物的用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种哺乳动物表达载体，其包含编码作为选择标记物的细菌谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的哺乳动物表达载体，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶衍生自肠杆菌目(enterobacterales)和摩根菌科(morganellaceae)的细菌，优选地其中所述细菌谷氨酰胺合成酶衍生自普罗威登斯菌属(providencia)物种或光杆状菌属(photorhabdus)物种，更优选地其中所述细菌谷氨酰胺合成酶是居幼虫普罗威登斯菌(providencia vermicola)谷氨酰胺合成酶或发光光杆状菌(photorhabdus luminescens)谷氨酰胺合成酶。
3.权利要求1或2的哺乳动物表达载体，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与seq idno:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自e130x、f226y、r345a及其组合的突变，其中x是任何氨基酸，优选地其中在氨基酸位置e130中的突变是用芳香族或疏水性氨基酸的取代，所述氨基酸更优选地选自y、w、f、a、g、v、l、m和i。
4.权利要求1至3中任一项的哺乳动物表达载体，其中所述细菌谷氨酰胺合成酶包含与seq id no:1或seq id no:14的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自e130x、f226y、r345a及其组合的突变，其中x是任何氨基酸，优选地其中在氨基酸位置e130中的突变是用芳香族或疏水性氨基酸的取代，更优选地所述芳香族或疏水性氨基酸选自y、w、f、a、g、v、l、m和i。
5.权利要求1至4中任一项的哺乳动物表达载体，其中所述哺乳动物表达载体进一步包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码rna的至少一种多核苷酸，优选包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码rna的至少一种多核苷酸的表达盒。
6.根据权利要求5的哺乳动物表达载体，其中所述感兴趣的蛋白质是治疗性蛋白质，优选地选自细胞因子、激素、融合蛋白、抗体、抗体衍生分子和抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·施密特，D·海因策尔曼，F·罗伊斯，S·菲舍尔，P·舒尔茨，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际公司，
类型：发明
国别省市：
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