【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种凋亡抑制因子5(apoptosis inhibitor 5,api5)基因敲除的thp-1细胞系及其构建方法与干扰载体。
技术介绍
1、thp-1细胞系最初是从一名急性单核细胞白血病患者的外周血中分离得到的，属于人类肿瘤细胞，广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路、病原体感染以及营养和药物运输等研究。thp-1比较接近人原代单核细胞的形态和功能特征，易于在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，有助于提高实验结果的重现性。因此，thp-1细胞是一种重要的研究工具，特别是在免疫学、炎症研究、药物开发和癌症研究领域，为科学家提供了一个可以重复和控制的实验模型。
2、api5(又叫aac-11，fif))蛋白是一个抗凋亡蛋白，在细胞生存和增殖中起关键作用。最初是作为一种能够抑制由缺乏生长因子引起的细胞凋亡的蛋白质被鉴定。api5能通过多种机制保护细胞免于凋亡，包括抑制某些细胞内凋亡信号通路，促进细胞增殖以及在特定条件下支持肿瘤细胞的生长和耐药性。api5与多种癌症的发生和发展密切相关，尤其是在那些对常规治疗产生抗性的肿瘤中更为突出。研究发现，api5在多种癌症细胞中表达上调，包括乳腺癌、肺癌和胃癌等。由于它在抗凋亡中的作用，api5成为了癌症治疗中潜在的靶标。api5还与其他细胞功能有关，例如细胞周期调控、dna修复以及应激反应。此外，api5在病毒感染过程中也具有重要的调控作用。它还可能参与免疫调控，影响细胞对免疫信号的响应。因此，研究api5的功能及其在不同病理状态下的作
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种api5基因敲除的thp-1细胞系及其构建方法和干扰载体。
2、一种敲除api5基因的thp-1细胞系的构建方法，包括以下步骤：
3、1)人api5基因shrna设计：根据人api5基因全长序列和psiren-retroq-zsgreen1-puro载体(简称psiren-u6)的信息设计并合成含有bam h i及ecor i酶切位点的靶向api5的引物序列；上游序列如seq id no.1所示；下游序列如seq id no.2所示；
4、2)api5干扰质粒(简称psiren-u6-shapi5)的构建：将api5 shrna引物退火形成互补双链，与经bamh i和ecor i酶切后的psiren-retroq-zsgreen1-puro载体经t4 dna连接酶连接，连接产物转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，挑选单克隆菌株进行测序，并提取阳性克隆菌的质粒。
5、3)api5 shrna重组慢病毒的包被：利用脂质体将2)中提取的psiren-u6-shapi5质粒与pspax2和pmd2.g按照4:3:1比例共转染hek293t细胞，转染后48h，将细胞冻存-80℃，冻融后离心取上清，获得psiren-u6-shapi5重组慢病毒。
6、4)api5基因敲除的thp-1稳定细胞系构建：将3)中获得的慢病毒感染thp-1细胞，经嘌呤霉素抗性筛选，获得稳定敲除api5基因的thp-1细胞系。
7、本专利技术进一步提供了根据上述的构建方法获得的api5干扰载体psiren-u6-shapi5。
8、本专利技术进一步提供了根据上述的构建方法获得的psiren-u6-shapi5重组慢病毒。
9、本专利技术进一步提供了根据上述构建方法获得的api5基因敲除thp-1细胞系。
10、本专利技术还提供了api5基因敲除的thp-1细胞系的用途，api5基因敲除显著抑制抗病毒天然免疫通路i型干扰素和炎症因子相关基因的表达。
11、api5基因敲除显著加速dsrna介导肿瘤细胞thp-1凋亡通路中casp3、casp7、casp8和casp9活化。
12、本专利技术的有益效果:①本专利技术公开了api5基因新功能，参与仙台病毒sev诱导抗病毒天然免疫信号激活和dsrna介导的肿瘤细胞凋亡过程。api5调控抗病毒天然免疫与dsrna介导的细胞凋亡通路为首次报道。借助于构建的api5基因敲除的thp-1细胞系，证实了敲除api5显著抑制sev诱导的抗病毒免疫相关基因(ifn-β、cxcl10、il-6和tnfa)的表达；其次，api5基因敲除显著加速了dsrna诱导肿瘤细胞thp-1中casp3、casp7、casp8和casp9的激活。②本专利技术建立得到的api5基因敲除的thp-1细胞系可以连续传代且能保持优良的特性，是研究api5基因功能的一种强有力的细胞模型，可用于体外探究api5在调控细胞凋亡、细胞增殖、免疫、炎症、dna修复和应激、病毒感染以及癌症等的研究，开拓了目前研究人api5功能的新方法。可用于药物筛选和制备，应用前景广泛。
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1.一种API5基因敲除的THP-1细胞系的构建方法，其特征是：包括以下步骤：
2.一种根据权利要求1所述的构建方法获得的特异性靶向API5的引物序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2所示。
3.一种根据权利要求1所述的构建方法获得的API5干扰载体及其重组慢病毒。
4.一种根据权利要求1所述的构建方法获得的API5基因敲除的THP-1细胞系。
5.一种根据权利要求4所述的API5基因敲除的THP-1细胞系的用途，其特征是：API5基因敲除显著抑制抗病毒天然免疫通路I型干扰素和炎症因子相关基因的表达。
6.一种根据权利要求4所述的API5基因敲除的THP-1细胞系的用途，其特征是：API5基因敲除显著加速dsRNA介导肿瘤细胞THP-1凋亡通路中CASP3、CASP7、CASP8和CASP9活化。
【技术特征摘要】
1.一种api5基因敲除的thp-1细胞系的构建方法，其特征是：包括以下步骤：
2.一种根据权利要求1所述的构建方法获得的特异性靶向api5的引物序列如seq idno.1、seq id no.2所示。
3.一种根据权利要求1所述的构建方法获得的api5干扰载体及其重组慢病毒。
4.一种根据权利要求1所述的构建方法获得的api5基因敲除的thp-1细胞...
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