【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及筛选植物寄生线虫拮抗菌，尤其涉及一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法。
技术介绍
1、连作障碍已成为影响设施农业及专业化种植业发展的限制性因素。其中，由连作引起的植物寄生线虫(主要为根结线虫)病已在全球造成每年高达1000多亿美元的经济损失。化学农药虽能在一定程度上减轻根结线虫病害，但因其毒性强、在农产品中残留及引起环境污染，限制了化学杀线剂在生产上广泛应用。绿色环保的微生物防治是目前解决农作物连作障碍的研究热点。筛选能够抑制连作障碍的微生物，探索这些微生物对植物寄生线虫病的防效、对作物的促生功能及其作用机制，是利用微生物防控植物寄生线虫病的基础。
2、植物寄生线虫不能在实验室人工培养，只能在寄主根系上侵染繁殖，导致抗植物寄生线虫生防菌的筛选因缺乏可快速培养的筛选靶标难以进行。秀丽隐杆线虫食细菌，可在实验室人工培养，如能作为抗植物寄生线虫生防菌的筛选靶标，就能大幅度加快植物寄生线虫生防菌筛选及杀线虫生物农药研究速度。秀丽隐杆线虫虽然不是植物寄生线虫，在食性上与植物寄生线虫有较大差异，但具有线虫的许多共性，有作为筛选植物寄生线虫生防菌靶标模式生物的可能，但目前对其可行性缺乏研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，包括秀丽隐杆线虫的培养与保藏方法和杀线微生物筛选
4、所述ngm培养基培养线虫方法包括以下步骤：
5、a1、ngm培养基制备；
6、a2、接入线虫；
7、a3、观察虫体；
8、所述燕麦培养基线虫培养方法包括以下步骤：
9、b1、燕麦培养基制备；
10、b2、接入线虫并培养；
11、b3、制备线虫悬液；
12、所述线虫保藏方法包括以下步骤：
13、c1、线虫快速冷冻；
14、c2、线虫水浴解冻；
15、所述杀线微生物筛选方法包括以下步骤：
16、d1、微生物发酵液制备：
17、d2、线虫悬液制备：
18、d3：杀线微生物筛选。
19、与现有技术相比，本申请通过不同的微生物发酵液对番茄根结线虫进行除虫作业并且将其和本方法中的结果进行对比，能表明本申请所得出的结论与筛选结果吻合，能了解本方法中所得出的致死率最高的微生物发酵液对根结线虫病具有良好防效果，说明利用秀丽隐杆线虫作为靶标筛选抗根结线虫等植物寄生线虫生防菌的技术方法具有可行性；同时方法克服了植物寄生线虫不能人工培养，只能在寄主植物上培养，培养周期长，靶标虫源不足，限制植物寄生线虫生防菌筛选的难题；为抗植物寄生线虫生防菌的快速筛选提供了一种简单高效、切实可行的新方法。
20、优选地，所述ngm培养基由nacl3g、蛋白胨2.5g、琼脂17g、1mol/lk2hpo4-kh2po4缓冲液(ph＝6.0)25ml和975ml蒸馏水组成；
21、所述接入线虫通过在ngm培养基灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固醇溶液(5mg/ml乙醇)、1mol/lmgso41ml、1mol/l的cacl21mlza；接种op50或e.coli培养两天后接入线虫；
22、所述观察虫体通过在将接入线虫后的ngm培养基置于20℃生化培养箱中培养，观察虫体的生长发育及形态。
23、进一步的，通过ngm培养基对线虫进行培养。
24、优选地，所述燕麦培养基由燕麦片l0g和水l0ml组成，将燕麦片l0g和水l0ml混匀后加入50ml三角瓶中，120℃高温灭菌20min；
25、所述接入线虫并培养是在超菌工作台中按无菌操作在燕麦片培养基中接入线虫，接种后的三角瓶放置于20℃的培养箱中培养7-10天后，置于4℃冰箱中保存备用；
26、所述制备线虫悬液在无菌条件下,挑取适量已培养好的含线虫的燕麦于擦镜纸上，用简易贝曼漏斗法洗出线虫，用无菌水制成线虫悬液备用。
27、进一步的，实现燕麦培养基对线虫进行培养。
28、优选地，所述线虫快速冷冻通过将线虫用无菌水洗净后放入30％甘油中，于-80℃在冻存管内保存；
29、所述线虫水浴解冻通过将水浴锅加热至38℃，快速将冻存管从冰箱取出后立即放入水浴锅内解冻。
30、进一步的，以便线虫的快速水浴解冻。
31、优选地，所述微生物发酵液制备包括细菌液制备、真菌液制备和放线菌液制备；
32、细菌液制备：在无菌条件下，挑取平板上已经活化好的菌株单菌落转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基上，120rpm，30℃恒温培养3天。下摇床后用离心机将菌体与发酵液分离，经微孔滤膜(0.22μm)抽滤除菌后将发酵液放于4℃冰箱保存备用；
33、真菌液制备：在无菌条件下，挑取平板上已经活化好的菌株单菌落转接到pda液体培养基上，120rpm，30℃恒温培养6天。下摇床后用离心机将菌体与发酵液分离，将发酵液放于4℃冰箱保存备用。
34、放线菌液制备：在无菌条件下，挑取平板上已经活化好的菌株单菌落转接到高氏1号液体培养基上，120rpm，30℃恒温培养8天。下摇床后用离心机将菌体与发酵液分离，将发酵液放于4℃冰箱保存备用。
35、进一步的，能精准的制备多种微生物发酵液，便于后续进行不同微生物发酵液对线虫致死率的检测。
36、优选地，所述线虫悬液制备通过向长满线虫的平板注入5ml无菌水，摇晃30s后倾斜放置2min，收集富集在皿边缘含有大量秀丽隐杆线虫的无菌水于10ml离心管内，振荡器振荡10秒，吸取1ml液体均匀涂布在方格计数板上，立体显微镜下计数，线虫悬液用无菌水稀释至5000条/ml。
37、进一步的，能有效保证试验条件的一致性，更好的提升试验效果。
38、优选地，所述杀线微生物筛选通过在96孔板内进行，每孔内加入130μl放线菌发酵液和20μl线虫悬液，以放线菌培养液为对照进行校正；每个菌设8个平行，在立体显微镜下观察线虫形态，虫体僵直不动视为死亡；24h后在立体显微镜下统计各孔内死亡线虫数目以计算致死率，同时还需计算校正致死率。
39、进一步的，能精准了解各发酵液对线虫的影响，以便精准计算发酵液对线虫的致死率。
40、优选地，所述致死率(％)＝24h内死亡线虫数量/线虫总数×100；所述校正致死率(％)＝发酵液致死率-培养液致死率。
41、进一步的，能以直观的形式对各发酵液的实际效果进行展示。
42、本专利技术的有益效果是：
43、1、本申请能通过ngm培养基和燕麦培养基进行线虫的培养，其材料简单，便本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：包括秀丽隐杆线虫的培养与保藏方法和杀线微生物筛选方法；所述秀丽隐杆线虫的培养与保藏方法包括NGM培养基培养线虫方法、燕麦培养基线虫培养方法以及线虫保藏方法：
2.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述NGM培养基由NaCl3g、蛋白胨2.5g、琼脂17g、1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH＝6.0)25ml和975ml蒸馏水组成；
3.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述燕麦培养基由燕麦片l0g和水l0mL组成，将燕麦片l0g和水l0mL混匀后加入50mL三角瓶中，120℃高温灭菌20min；
4.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述线虫快速冷冻通过将线虫用无菌水洗净后放入30％甘油中，于-80℃在冻存管内保存；
5.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述微生物发酵液制备包括细菌液制备、真菌液制备和放线菌液制备；>
6.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述线虫悬液制备通过向长满线虫的平板注入5ml无菌水，摇晃30s后倾斜放置2min，收集富集在皿边缘含有大量秀丽隐杆线虫的无菌水于10ml离心管内，振荡器振荡10秒，吸取1ml液体均匀涂布在方格计数板上，立体显微镜下计数，线虫悬液用无菌水稀释至5000条/ml。
7.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述杀线微生物筛选通过在96孔板内进行，每孔内加入130μl放线菌发酵液和20μl线虫悬液，以放线菌培养液为对照进行校正；每个菌设8个平行，在立体显微镜下观察线虫形态，虫体僵直不动视为死亡；24h后在立体显微镜下统计各孔内死亡线虫数目以计算致死率，同时还需计算校正致死率。
8.根据权利要求8所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述致死率(％)＝24h内死亡线虫数量/线虫总数×100；所述校正致死率(％)＝发酵液致死率-培养液致死率。
...【技术特征摘要】
1.一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：包括秀丽隐杆线虫的培养与保藏方法和杀线微生物筛选方法；所述秀丽隐杆线虫的培养与保藏方法包括ngm培养基培养线虫方法、燕麦培养基线虫培养方法以及线虫保藏方法：
2.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述ngm培养基由nacl3g、蛋白胨2.5g、琼脂17g、1mol/lk2hpo4-kh2po4缓冲液(ph＝6.0)25ml和975ml蒸馏水组成；
3.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述燕麦培养基由燕麦片l0g和水l0ml组成，将燕麦片l0g和水l0ml混匀后加入50ml三角瓶中，120℃高温灭菌20min；
4.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述线虫快速冷冻通过将线虫用无菌水洗净后放入30％甘油中，于-80℃在冻存管内保存；
5.根据权利要求1所述的一种高效筛选植物寄生线虫拮抗菌的方法，其特征在于：所述微生物发酵液制备包...
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