【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，属于环境监测。
技术介绍
1、许多肠道病毒，包括轮状病毒、诺如病毒和腺病毒等，都可以在人类粪便中排出，即使是通过空气传播的sars-cov-2等病毒也可以在人类粪便中检测到存在。这些病毒通过粪便进入外环境水体后，可以通过粪-口途径再次感染人体，形成社区内传播，进而引发暴发性疫情，因此，检测和定量污水中这些病毒的浓度对于两个重要目标至关重要。首先，这一检测结果对于评估人类在无意中接触污水时可能面临的暴露风险具有关键意义；其次，以污水为基础的流行病学(wbe)研究有可能成为检测社区中病毒传播的强大工具，甚至在临床病例出现之前就能提供预警。然而，水中病毒监测的最大挑战是，污水中的病毒浓度可能低于定量荧光聚合酶链反应(qpcr)系统等仪器的检测低限，特别是在病毒的社区传播还处于早期阶段时。虽然诺如病毒、腺病毒和肠道病毒等病毒以高浓度排出(高达1011基因拷贝(gc)/g粪便)，但病毒会被不同的水体稀释，到了河水中的病毒浓度可能已经下降到101～102gc/l。由于qpcr检测的下限约为10gc/μl(或106gc/l)，要想通过qpcr检测到大量污水中的病毒，大体积污水样本必须浓缩成更小的体积，才能使病毒得以浓缩。污水中浓缩病毒的几种传统策略包括超速离心法、离心超滤法、吸附-洗脱法、铝盐絮凝沉淀法和聚乙二醇(peg)沉淀法。以下对各种方法进行概述和比较。
2、超速离心法利用不同的离心力将样品各组分分离，在不同的离心力作用下，可以分离将大分子物质、线粒体、细菌、其他物质和
3、病毒吸附-洗脱(viradel)富集法中，水样通过带有正电荷或负电荷的过滤膜，由于病毒颗粒和膜的静电吸引，病毒被截留在膜上，膜上的病毒通过洗脱液初次洗脱后，洗脱液一般还要经过二次浓缩才能提取核酸进行qpcr检测。在阴离子膜吸附洗脱法中，过滤前和洗脱后还需要进行水样ph调整以提高洗脱效率。viradel法适用于低浊度的水样，而高浊度的水样本必须经过预过滤。大体积水样(一般大于10l)浓缩同时带来了qpcr抑制物质的富集，除了这一不足，viradel法还有步骤较多带来的耗时和病毒回收率损失的缺点。
4、离心超滤法采用了滤膜过滤的原理，滤膜的孔径比病毒颗粒小，通过离心作用将病毒截留在超滤管内，而水被滤过。这种方法同样对水的浊度有很高的要求，高浊度的水极易堵塞超滤管。离心超滤法对原始水样体积的要求从10l(viradel富集法)降低至100ml，这使得水样的处理更便捷，更省时，同时提高了水处理的通量。当然，超滤法存在耗材昂贵，依赖水平转子离心机的缺点。
5、聚乙二醇(peg)是一种“惰性溶剂海绵”，它将水分子从病毒衣壳周围的蛋白质溶解层中隔离出来，增强病毒与病毒的相互作用，并导致病毒沉淀。由于非选择性的沉淀，peg沉淀法同样导致qpcr抑制物质的浓缩，干扰qpcr的检测准确性。peg沉淀法和超速离心法一样依赖高速离心机，且离心耗时很长。
6、铝盐絮凝沉淀法主要是通过在水中加入可溶性铝盐和碱性物质，形成氢氧化铝沉淀。这个过程中，带正电荷的铝离子会与带负电荷的病毒颗粒充分结合，从而实现病毒的富集。铝盐混凝沉淀需要调节水样的ph值到6以及控制铝盐的投加量来达到更好的病毒富集效果。当然，沉淀过程中qpcr干扰物质同样会得到富集。铝盐絮凝沉淀法相比前几种方法成本是最小的，操作也很简单，不依赖特殊的离心设备。
7、这些传统的病毒浓缩方法有些耗材昂贵、有些繁琐耗时，有些依赖特殊设备，这些方法都无法完全去除水样中qpcr干扰物质。因此，迫切需要一种简单、快速、成本较小、不依赖特殊大型设备而且可以去除qpcr干扰物质的新型病毒浓缩方法。磁珠吸附法应该是其中最有前景的一种。
8、已知诺如病毒(novs)特异性识别人胃肠道粘膜上表达的组织血型抗原分子(hbgas)。利用nov与hbgas结合的特性，研究者开发了一种hbga偶联磁珠(mb)结合试验，使用合成hbgas偶联磁珠(hbgas-mb)来捕获环境样品中低拷贝数的novs。由于获得用于研究的合成hbgas的困难和成本，一些研究人员使用猪胃粘蛋白(pgm)作为合成hbgas的替代品。已有研究证明了pgm与重组诺如病毒样颗粒(rnvlp)可以有效结合，并对rnvlp与hbgas结合存在竞争性抑制作用。考虑到pgm是一种生物底物，其中包括作为病毒受体的分子(如多聚糖)，本专利技术认为它可能也可以结合除诺如病毒之外的病毒，例如札如病毒、腺病毒、轮状病毒、甚至新冠病毒等。根据上述猜测，本专利技术设计将pgm偶联上磁珠，制成pgm-mb，利用这些pgm-mb选择性地从污水中浓缩病毒。使用pgm-mb富集水中病毒的第一个优点是，它们可以捕获具有感染性的病毒颗粒而不是残存的病毒基因组，因为只有具有完整的病毒衣壳才能和受体(pgm分子)结合(病毒衣壳和细胞表面受体结合是病毒感染细胞的开始)，从而获得更准确的传染性病毒载量数据，而仅凭qpcr是无法分辨水中富集的是病毒基因组还是完整的病毒颗粒。因而pgm-mb富集法更有利于评估各种环境水体潜在的感染风险。第二点是pgm-mb法选择性地吸附病毒，避免了水中qpcr干扰物质对后续检测的影响。第三优点是成本较小，步骤简单，不依赖大型特殊设备。
9、本专利技术旨在利用猪胃粘蛋白偶联磁珠(pgm-mb)设计这种基于受体的病毒浓缩方法，并评价pgm-mb与常规铝盐絮凝沉淀法的富集效果。研究结果表明，pgm-mbs可以是一种简单、经济、准确的wbe工具。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一种基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其测量结果简单，测量过程经济、准确。
2、本专利技术的技术方案，一种基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，采用猪胃粘蛋白偶联羧基衍生磁珠，随后利用猪胃粘蛋白上的多糖分子来捕获待测污水中的病毒颗粒，收集磁珠后通过热变性的方法获得病毒的核酸，最后进行荧光定量pcr的检测来确定污水病毒种类和具有感染性的病毒浓度。
3、进一步地，所述病毒具体为诺如病毒gi、诺如病毒gii、轮状病毒、札如病毒、腺病毒和新冠病毒。
4、进一步地，所述病毒具体为诺如病毒gi、诺如病毒gii、轮状病毒和新冠病毒。
5、进一步地，步骤如下：
6、(1)配样：吸取羧基衍生磁珠至pbs缓冲液中，稀释后的磁珠浓度为2×107个/ml；稀释后的磁珠用pbs缓冲液清洗若干次，每次清洗后收集磁珠；将8-12mg typeⅲ猪胃粘液蛋白溶解于1ml mes缓冲液，得到猪胃粘液蛋白缓冲液；
7、(2)混匀：在猪胃粘液蛋白缓冲液中加入清洗后的磁珠8-12μl，并立刻加入100μl10mg/ml的edc缓冲液中，得到含有磁珠的混合液；将含有磁珠的混合液置于数显试管旋转混匀仪上室温旋转混匀；
8、(3)重悬：步骤(2)混匀结束后用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是：采用猪胃粘蛋白偶联羧基衍生磁珠，随后利用猪胃粘蛋白上的多糖分子来捕获待测污水中的病毒颗粒，收集磁珠后通过热变性的方法获得病毒的核酸，最后进行荧光定量PCR的检测来确定污水病毒种类和具有感染性的病毒浓度。
2.如权利要求1所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是：所述病毒具体为诺如病毒GI、诺如病毒GII、轮状病毒、札如病毒、腺病毒和新冠病毒。
3.如权利要求2所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是：所述病毒具体为诺如病毒GI、诺如病毒GII、轮状病毒和新冠病毒。
4.如权利要求1所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：
5.如权利要求4所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：步骤(2)在数显试管旋转混匀仪上以5-15rpm速度室温旋转混匀20-40min。
6.如权利要求4所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：步骤(4)中采集水样若浊度很高，可采用重力沉淀1-3h，或经过0.22μM
7.如权利要求4所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：步骤(5)中将水样磁珠混合液置于数显试管旋转混匀仪以20-40rpm速度旋转混匀20-40min。
8.如权利要求4所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：步骤(7)中病毒核酸使用札如病毒/星状病毒/肠道腺病毒三重核酸检测试剂盒、轮状病毒A组/诺如病毒(G1\G2型)检测试剂盒及及新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR检测。
9.如权利要求4所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：
10.如权利要求1-9之一所述方法，其特征是：将其应用于环境水样中的多种病毒检测。
...【技术特征摘要】
1.一种基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是：采用猪胃粘蛋白偶联羧基衍生磁珠，随后利用猪胃粘蛋白上的多糖分子来捕获待测污水中的病毒颗粒，收集磁珠后通过热变性的方法获得病毒的核酸，最后进行荧光定量pcr的检测来确定污水病毒种类和具有感染性的病毒浓度。
2.如权利要求1所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是：所述病毒具体为诺如病毒gi、诺如病毒gii、轮状病毒、札如病毒、腺病毒和新冠病毒。
3.如权利要求2所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是：所述病毒具体为诺如病毒gi、诺如病毒gii、轮状病毒和新冠病毒。
4.如权利要求1所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：
5.如权利要求4所述基于受体偶联磁珠富集污水中病毒的方法，其特征是步骤如下：步骤(2)在数显试管旋转混匀仪上以5-15rpm速度室温旋转混匀20-40min。
6.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯微宏，王雅静，韩毅，管红霞，
申请(专利权)人：无锡市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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