【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单核细胞增生李斯特氏菌检测，特别是一种单核细胞增生李斯特氏菌mira快速检测引物探针组及方法。
技术介绍
1、单核细胞增生性李斯特菌(listeria monocytogenes，lm)简称单增李斯特菌。单增李斯特菌可以感染许多食品，包括家畜肉、发酵香肠和海产品等。who将其与大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。它是李斯特菌属中致病力最强的细菌。单增李斯特菌在自然界分布广泛，如在腐烂的植物、土壤、动物粪便、污水中均有发现；在乳肉蛋制品、蔬菜和海产品中也都有不同程度的污染。奶酪、凉拌卷心菜、热狗、禽肉、海鲜等是引起李斯特菌病的常见食品。由于单增李斯特菌作为人畜共患病菌，分布广泛，4℃下正常繁殖，对食品安全构成了严重的威胁，因此各国对食品中单增李斯特菌纷纷做出规定，美国要求出售食品中不得出现单增李斯特菌，加拿大规定即食食品中单增李斯特菌的数量不超过100cfu/g，中国规定即食生制动物性水产制品中单增李斯特菌的数量不超过100cfu/g。这些规定要求能够准确地测出食品中的少量单增李斯特菌。
2、目前单增李斯特菌的鉴定多采用国标法、酶联免疫法、pcr方法、lamp法。
3、1、生理生化检测法(国标法)
4、国家标准中eb增菌法和lb增菌法，通过微生物的分离培养、生化反应、溶血试验、协同溶血试验、动物试验等进行分离鉴定。实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6-7天。这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市
5、2、酶联免疫法
6、免疫测定是基于抗体对抗原亲和力的一种检测技术，该方法不易受到样品中其他成分的干扰，可以精确测定少量样品中的抗原。免疫学检测法操作快捷，特异性强，灵敏度高，但是制备单克隆抗体的成本较高。而且李斯特菌的菌体和鞭毛之间存在抗原交叉反应，降低了检测的特异性。
7、3、核酸检测法
8、(1)聚合酶链式反应法(pcr法)
9、pcr技术自1980年被专利技术以来，已经得到了广泛的应用。其方法是用一对寡聚dna作为引物，将要扩增的dna经过高温解链，退火，最后进行复制延伸。如此重复25～35个循环就可以得到大量dna。单增李斯特菌的检测，其特异性引物的设计一种是依据它的特异毒力基因序列(常用hlya，iap，inl，dth)，一种是依据它的基因组序列中的特异序列(16s或16s/23s中间的保守区域)。姜永强等以单增李斯特菌的hlya毒力基因为靶序列，可检出4cfu/ml的牛奶。wang等以pcr扩增单增李斯特菌的iap毒力基因片断，可检出1～2cfu/ml牛奶样品。
10、graham等用16s/23s rrna基因中间保守区域进行pcr扩增，对单增李斯特菌的特异性进行了研究，为检测提供了依据。然而pcr过程中涉及多个温度的变换，需要用到昂贵的pcr仪和凝胶成像仪等设备，对检测环境要求高，现有的pcr检测技术无法满足现场快速检测单增李斯特菌的要求。
11、(2)lamp法
12、环介导等温扩增法lamp是由日本人notomi研制出的一种新型核酸检测法。lamp分析方法具有特异性好、灵敏度高和成本低等优点。该方法已成为食品工业和公共卫生机构在不需要精密设备的情况下快速诊断微生物的一个有价值的工具。陈东等基于iap基因的rt-lamp技术对肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的检测效果进行了评价。同时rt-lamp也被用于检测rna病毒的基因组，目前已经开发了多个病毒检测试剂盒。然而，lamp法引物设计困难，会因多引物存在产生二聚体而出现假阳性结果。
13、综上所示，上述方法均存在检测繁琐、操作复杂且耗时费力，且特异性和灵敏度不太高的问题。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种单核细胞增生李斯特氏菌mira快速检测引物探针组及方法。
2、为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
3、本专利技术的目的之一是要提供一种单核细胞增生李斯特氏菌mira快速检测引物探针组，所述引物探针组由正向引物、反向引物和探针组成；
4、所述正向引物序列如seq id no.1所示，具体为：
5、5’-caaaaccagctcccgcaccatctacaaayac-3’；
6、所述反向引物序列如seq id no.2所示，具体为：
7、5’-gttagaagaaccttgattagcattcgtatttgag-3’；
8、所述探针序列如seq id no.3所示，具体为：
9、5’-tgctaataaaacgaatacgaatacaaacaatactaatacaagtaca cca-3’；且在其5’端起第31位碱基t标记6-fam，第33位碱基c标记d spacer即四氢呋喃，第34位碱基t标记bhq1，同时，在3’末端标记c3-spacer。
10、本专利技术的目的之二是要提供一种单核细胞增生李斯特氏菌mira快速检测方法，包括如下步骤：提取待测菌的基因组dna，用权利要求1所述引物探针组对待测菌进行实时荧光mira扩增，以单核细胞增生李斯特氏菌cmcc(b)54002为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，观察扩增后的结果。
11、具体地，所述实时荧光mira扩增反应体系为：29.4μl的a缓冲液、2μl的10μmol/l正向引物、2μl的10μmol/l反向引物、0.6μl的10μmol/l探针、2μl的单核细胞增生李斯特氏菌dna模板、11.5μl的ddh2o和2.5μl的b缓冲液。
12、优选地，所述实时荧光mira扩增反应温度为40℃，时间为20min。
13、与现有技术相比，本专利技术提供了能够对单核细胞增生李斯特氏菌特异性靶基因进行高效扩增的引物对，以及单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测探针，构建了快速、准确、有效地检测单核细胞增生李斯特氏菌的多酶恒温快速扩增检测方法，检测特异性和灵敏度高，具有推广应用价值。
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1.一种单核细胞增生李斯特氏菌MIRA快速检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组由正向引物、反向引物和探针组成；
2.一种单核细胞增生李斯特氏菌MIRA快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测菌的基因组DNA，用权利要求1所述引物探针组对待测菌进行实时荧光MIRA扩增，以单核细胞增生李斯特氏菌CMCC(B)54002为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，观察扩增后的结果。
3.根据权利要求2所述的单核细胞增生李斯特氏菌MIRA快速检测方法，其特征在于，所述实时荧光MIRA扩增反应体系为：29.4μL的A缓冲液、2μL的10μmol/L正向引物、2μL的10μmol/L反向引物、0.6μL的10μmol/L探针、2μL的待测基因组DNA模板、11.5μL的ddH2O和2.5μL的B缓冲液。
4.根据权利要求3所述的单核细胞增生李斯特氏菌MIRA快速检测方法，其特征在于，所述实时荧光MIRA扩增反应温度为40℃，时间为20min。
【技术特征摘要】
1.一种单核细胞增生李斯特氏菌mira快速检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组由正向引物、反向引物和探针组成；
2.一种单核细胞增生李斯特氏菌mira快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测菌的基因组dna，用权利要求1所述引物探针组对待测菌进行实时荧光mira扩增，以单核细胞增生李斯特氏菌cmcc(b)54002为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，观察扩增后的结果。
3.根据权利要求2所述的单核细胞增生...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐欣，徐文英，沈葆真，王龙祥，周霞，李少龙，杨爱馥，曲世超，褚莹倩，张晓林，薛伟锋，
申请(专利权)人：大连海关技术中心，
类型：发明
国别省市：
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