【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其是一种提高微生物油脂及神经酸产量的发酵方法、菌株和应用。
技术介绍
1、油脂是食品、能源、化工的基础原料，需求量大。中国每年进口各类油料作物约1亿吨，2023年仅大豆的进口量就达到了9941万吨，对外依存度超过82％。目前，油脂的来源以油料植物为主，占用大量耕地，如果完全依靠国内种植大豆，需要6～8亿亩耕地，对仅有18亿亩耕地的中国而言无法保证粮食供给安全。此外，中国连续多年进口食用油近千万吨，对外依存度高。可见，油脂短缺是影响国计民生的重要问题。
2、随着合成生物学的快速发展，以产油微生物为底盘，利用可再生原料合成微生物油脂，成为油脂获取的新路线。天然微生物油脂的脂肪酸组成以十六碳和十八碳脂肪酸为主，与植物油的成分相近，可替代植物油脂。并且，与植物油脂相比，微生物油脂具有原料来源广、发酵生产不受季节限制、易规模化生产和管理等优点。常规的微生物油脂生产成本仍高于大豆、棕榈等植物油脂，而功能油脂的价值高，市场竞争力强，符合微生物油脂产业的近期发展趋势。多种脂肪酸酯为人体必需，具有重要的健康和医药应用价值，例如ω-3多不饱和必需脂肪酸类的二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)已商业化应用。单不饱和脂肪酸对人体健康也具有重要作用，其中，神经酸具有治疗神经脱髓鞘疾病、促进神经发育、缓解运动紊乱等功能，展现了广阔的应用前景。
3、神经酸主要来源包括动物源的鲨鱼，植物源的蒜头果、元宝枫、碎米芥、微藻，以及少数霉菌。从鲨鱼来源的不可持续性导致动物性神经酸的来源不稳定，研究人员开始转而寻
4、产油微生物具有可定制化合成脂肪酸的优势，是生产神经酸的新型路线，有望大幅降低生产成本，革新神经酸的获取方式。产油微生物解脂耶氏酵母，其油脂积累可超过细胞干重的70％，生长速度显著快于酿酒酵母，并且具有发酵密度高、遗传操作简单、碳源利用谱广和安全性高等诸多优点，已成为脂肪酸开发的优势底盘。以葡萄糖、甘油为原料在解脂耶氏酵母中进行油脂的合成已经被广泛而深入地研究，然而，这些碳源的高成本阻碍了它们在微生物脂质生产中的应用。在这方面，乙酸作为一种低成本的底物在生物
显示出巨大的潜力。乙酸和葡萄糖的含碳量相当，它们每30个分子量都含有1个碳原子，乙酸和葡萄糖的价格分别约为每吨324美元和479美元。因此，在相同的价格下，乙酸的质量比葡萄糖的质量大32％。解脂耶氏酵母在基于糖平台的油脂合成中显示了优良的特性，因此基于乙酸平台的底物代谢及油脂合成亟待研究。然而，直接利用乙酸的合成产物油脂比葡萄糖合成的要慢，酶促反应步骤多。为此在本专利技术中辅助以葡萄糖作为补充碳源细胞主要提供还原力，以进行高能量生物产品的合成。葡萄糖和乙酸盐作为共底物以提供更多能量并降低能耗。此外，在发酵工程、过程工程方面采用多种策略来提高利用率。最终，经过工程改造后的微生物利用乙酸盐生产的各种生化产品的效价和产率都达到更加理想的水平。
5、在解脂耶氏酵母中，从酰基辅酶a组装形成tag的过程中使用甘油3-磷酸为底物同时消耗酰基辅酶a，并通过4种连续的酰基转移酶将酰基辅酶a依次转移到er中甘油3-磷酸的sn-1,-2和-3位置，这些酶包括甘油3-磷酸酰基转移酶(gpat)、溶血磷脂酰基转移酶(lpat)、磷脂酸磷酸酶(pap)和二酰甘油酰基转移酶(dgat)，最终形成脂滴储存在细胞质中。目前自然界中已知神经酸含量最高的植物种子是蒜头果，对蒜头果早期阶段(神经酸占总脂0.88％)和中期果实(神经酸占总脂29.39％)两个发育阶段的种子转录组测序发现这4种连续的酰基转移酶中的gpat,lpat和dgat2在中期果实的油脂快速积累阶段表达量有显著提升。推测酰基转移酶存在底物选择性，可以选择性的促进c18:1-coa组装形成tag，同时特异性的酰基转移有利于竞争c16和c18前体物质。因此在本专利技术中，计划通过筛选特异性的酰基转移酶来增强底盘细胞对神经酸的酯化过程以此来提高神经酸的产量。
6、tag形成过程中所需要的酰基转移酶，包括gpat、lpat和dgat，对不同的酰基辅酶a有偏好性。蒜头果数的种子中可以积累超过55％的c24:1δ15，但蒜头果中的的酰基转移酶是否更倾向于c24:1δ15尚不清楚。甘油三酯主要由酵母通过“甘油-3-磷酸途径”产生。脂酰辅酶a(fa-coa)与甘油-3-磷酸(g3p)反应产生的溶血磷脂酸(la)由甘油-3-磷酸酰基转移酶(gpat)催化产生。接下来，溶血磷脂酸在1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(lpat)和脂肪酰基辅酶a的作用下转化为磷脂酸(pa)。磷脂酸磷酸酶(pap)催化二甘油酯(dag)的合成。二酰甘油酰基转移酶(dgat)结合脂肪酰基coa和dag在内质网膜内生成甘油三酯。最终，内质网相对侧形成脂质体。在解脂耶氏菌菌株中，大多数脂肪酸以tag、二酰基甘油(dag)和单酰基甘油(mag)的脂质形式存在。一旦c16-酰基coa和c18-酰基coa被酯化形成脂质，它们就不能被延申为24:1-酰基coa来合成神经酸。因此，选择偏好c24:1-酰基辅酶a的酰基转移酶可以在包含c16酰基辅酶a、c18酰基辅酶a的脂酰辅酶a库中特异性的催化更多c24:1形成tag，进而形成脂滴储存，以此提高神经酸的产量。溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidicacid acyltransferase,lpat)同样作为植物种子tag组装过程中的一类重要的限速酶，在脂酰辅酶a的选择性酯化过程中具有重要意义。目前，超长链单不饱和脂肪酸的合成在植物中认识较为清楚。植物以c18:1为直接底物，通过超长链脂肪酸链延长循环进行碳链的延长，每次循环能够使原有脂肪酸的碳链延长两个碳原子。这个延长过程受4个酶(kcs、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产微生物油脂及神经酸的基因工程菌株，其特征在于：所述菌株以菌株YLNA9为出发菌株，并通过强化特异性酰基转移酶的表达、强化脂肪酸延长酶复合物的表达、敲除假菌丝形成基因、敲除硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD基因得到的。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述特异性酰基转移酶的基因序列为SEQ ID No.1，其氨基酸序列为SEQ ID No.2；所述脂肪酸延长酶复合物的基因序列为SEQ ID No.3；所述假菌丝形成基因的基因序列为SEQ ID No.4；所述硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD基因的基因序列为SEQ ID No.5。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株发酵后油脂及神经酸的产量达到46.3g/L，油脂产量达到181.3g/L。
4.如权利要求1至3任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：在菌株YLNA9的基础上表达酰基转移酶MoLPAT获得菌株YL2；在YL2中增强KCR、HCD和ECR的表达量，获得菌株YL3；在YL3中敲除假菌丝形成基因RAS，获得菌株YL4；在菌株YL4中
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
6.如权利要求1至3任一项所述的基因工程菌株在同时油脂及神经酸产量中的应用。
7.一种利用如权利要求1至3任一项所述的基因工程菌株提高微生物油脂及神经酸产量的发酵方法，其特征在于：所述方法在解脂耶氏酵母底盘细胞中，通过系统代谢工程获得了神经酸高产细胞工厂，在此基础上利用基因工程菌株并通过发酵培养基和发酵工艺的优化，进一步提高了神经酸和油脂产量的产量。
8.根据权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于：所述基因工程菌株以乙酸为碳源进行发酵罐补料分批发酵的步骤如下：
10.如权利要求7至9任一项所述的方法在同时生产微生物油脂和神经酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高产微生物油脂及神经酸的基因工程菌株，其特征在于：所述菌株以菌株ylna9为出发菌株，并通过强化特异性酰基转移酶的表达、强化脂肪酸延长酶复合物的表达、敲除假菌丝形成基因、敲除硬脂酰辅酶a去饱和酶scd基因得到的。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述特异性酰基转移酶的基因序列为seq id no.1，其氨基酸序列为seq id no.2；所述脂肪酸延长酶复合物的基因序列为seq id no.3；所述假菌丝形成基因的基因序列为seq id no.4；所述硬脂酰辅酶a去饱和酶scd基因的基因序列为seq id no.5。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株发酵后油脂及神经酸的产量达到46.3g/l，油脂产量达到181.3g/l。
4.如权利要求1至3任一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于：在菌株ylna9的基础上表达酰基转移酶molpat获得菌株yl2；在yl2中增强kcr、hcd和ecr的表达量，获...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏航，樊伟明，孟祥燕，陈燕娜，王士安，李福利，苏娟娟，
申请(专利权)人：浙江震元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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