【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，尤其涉及酪氨酸激酶抑制剂在制备car-t细胞中的应用。
技术介绍
1、达沙替尼(dasatinib)，是src和bcr-abl酪氨酸激酶的小分子抑制剂，主要用于治疗伊马替尼(imatinib)耐药或不能耐受的慢性髓性白血病及费城染色体阳性(ph+)急性淋巴细胞白血病，通过抑制btk和tec的激酶活性，抑制恶性肿瘤细胞的增殖和存活，同时影响原代人嗜碱性粒细胞的组胺释放和免疫细胞中促炎细胞因子的分泌，具有免疫抑制作用。有研究报道，达沙替尼可逆地抑制tcr和car-t信号传导降低car-t细胞因子分泌能力，通过药理开关作用调控car-t细胞体内功能并减轻crs等副反应，提升car-t细胞治疗的安全性。
2、嵌合抗原受体t(car-t)细胞疗法通过将患者或供者t淋巴细胞在体外经过基因修饰使其表达肿瘤特异性抗原受体，可与肿瘤细胞表面特异性抗原结合，通过分泌杀伤性细胞因子，诱导免疫反应等方式发挥出强大的抗肿瘤活性。靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞疗法已经在复发/难治性急性淋巴白血病(all)等恶性血液肿瘤的治疗中取得了令人瞩目的效果，在实体瘤治疗领域car-t的治疗仍然面临诸多挑战。car-t细胞分化和耗竭导致的功能障碍以及实体瘤复杂的免疫抑制微环境等因素是car-t细胞体内持续性不佳和攻克实体肿瘤面临的主要障碍。因此，提升记忆细胞比例逆转t细胞耗竭，优化car-t细胞功能对于预防治疗后复发和提升实体肿瘤的治疗效果有重要的意义。
3、细胞冻存是car-t细胞产品生产的最后工序，冻存的产品于
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了酪氨酸激酶抑制剂在制备car-t细胞中的应用。本专利技术发现酪氨酸激酶抑制剂dasatinib在car-t培养过程中的添加可以提升细胞活率和耐受冻存损伤的能力，提升car-t细胞体外杀伤肿瘤和ifn-γ分泌水平。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了酪氨酸激酶抑制剂在制备car-t细胞中的应用。
4、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂包括dasatinib。
5、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂包括以下任意项的应用；
6、(i)、提高所述car-t细胞的活率；和/或
7、(ii)、提升所述car-t细胞抵抗冻存损伤的能力；和/或
8、(iii)、提升所述car-t细胞体外杀伤能力；和/或
9、(iv)、提升所述car-t细胞的ifn-γ分泌水平。
10、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于1μm。
11、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于100nm。
12、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度为50nm。
13、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂的添加方式包括但不限于：
14、当病毒转导5天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育4～6天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
15、当病毒转导1天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育7～10天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂。
16、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，当病毒转导5天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育4天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
17、当病毒转导5天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育6天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
18、当病毒转导1天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育7天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
19、当病毒转导1天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育10天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂。
20、本专利技术还提供了car-t细胞的制备方法，取pmbc病毒转导后，扩增，获得所述car-t细胞；
21、所述扩增采用上述应用中的所述酪氨酸激酶抑制剂和0～50ng/ml细胞因子。
22、在本专利技术的一些实施方案中，上述应用中，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于1μm。
23、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于100nm。
24、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度为50nm。
25、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述扩增的时间为4～10天。
26、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述扩增的时间为4天、6天、7天或10天。
27、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述扩增包括以下步骤：
28、当所述病毒转导5天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育4～6天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
29、当所述病毒转导1天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育7～10天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂。
30、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，当病毒转导5天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育4天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
31、当病毒转导5天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育6天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
32、当病毒转导1天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育7天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂；或
33、当病毒转导1天后，添加所述酪氨酸激酶抑制剂，孵育10天后，去除所述酪氨酸激酶抑制剂。
34、在本专利技术的一些实施方案中，上述制备方法中，所述细胞因子包括：0～20ng/mlil7和/或0～50ng/ml il21。
35、在本专利技术的一些实施方案中，所涉及的car-t细胞培养方案，包括但不限于采用pbmc或纯化富集的t淋巴用cd3/tcr复合物的抗体或/和刺激细胞表面上的共刺激分子cd28/cd137的抗体或免疫磁珠进行细胞活化。将活化的t细胞转导慢病毒载体，细胞在含il-2/il-7il-15/il-21等细胞因子或其组合因子的细胞培养基扩增培养至day7～21天收获。
36、在本专利技术的一些实施方案中，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指一组工程化多肽或蛋白，当其在免疫效应细胞中时，与靶细胞上包含的特定抗原结合，并在识别所述特定抗原后产生细胞内信号，激活所述受体所在细胞的下游通路，以启动所述免疫效应细胞对所述靶细胞的杀伤作用。所述免疫效应细胞包括但不限于nk细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.酪氨酸激酶抑制剂在制备CAR-T细胞中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂包括Dasatinib。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂包括以下任意项的应用；
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于1μM。
5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂的添加方式包括但不限于：
6.CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，取PMBC病毒转导后，扩增，获得所述CAR-T细胞；
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于1μM。
8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述扩增的时间为4～10天。
9.如权利要求6至8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述扩增包括以下步骤：
10.如权利要求7至9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子包括：0～20ng/mL IL7和/或0～50ng/m
...【技术特征摘要】
1.酪氨酸激酶抑制剂在制备car-t细胞中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂包括dasatinib。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂包括以下任意项的应用；
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂的浓度大于0不大于1μm。
5.如权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂的添加方式包括但不限于：
6.car-t细胞的制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琳玲，杨智，张茜真，王美玲，沈俊杰，陈军，齐亚男，黄一，李运燕，郑姣，王戬，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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