【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种rthb蛋白突变体及其在异亮氨酸生产中的应用。
技术介绍
1、l-异亮氨酸属于三支链氨基酸，也是人体八种必需氨基酸之一，在人类生命代谢中占有特别重要的地位，若人体中长期缺乏异亮氨酸，会影响机体的生理机能，导致代谢紊乱、机体抵抗力下降等，也因其特殊的结构和功能，被广泛应用于食品、药品、保健品、化妆品等领域。
2、国内和国际上生产l-异亮氨酸的方法主要是微生物发酵法，该方法的主要优点是对设备要求低、原料相对便宜、反应条件较为温、便于大规模生产等。目前常用的l-异亮氨酸生产菌有钝齿棒杆菌(corynebacterium crenatum)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、大肠杆菌(escherichiacoli)、乳酸发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)等，这些菌株的发酵不需要添加前体物质，微生物直接利用自身代谢合成所需的氨基酸。有研究发现，胞内氨基酸浓度过高将制约高产菌株的最终产量，比如胞内异亮氨酸浓度过高会对其代谢路径上的相关合成酶产生负反馈作用，而降低其胞内异亮氨酸浓度不仅能减弱负反馈作用，还可以提高异亮氨酸的产量。同时发酵法产异亮氨酸时，苏氨酸作为异亮氨酸合成路径上的中间产物，会出现在发酵液中，该副产物会成为异亮氨酸产品中的杂质。rthb家族(耐受高丝氨酸/苏氨酸家族)转运蛋白具有向胞外转运苏氨酸的能力，有生物信息学方法预测rthb家族中ncgl2566编
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于将rthb转运蛋白家族中ncgl2566基因编码的蛋白进行改造，以弱化异亮氨酸的反馈抑制和/或减少异亮氨酸中杂酸含量，从而提高异亮氨酸产量和纯度。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了下述技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种rthb蛋白突变体，所述rthb蛋白突变体是将seq idno:1所示氨基酸序列第16位、21位、117位、156位进行单突变或多位点突变获得的。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述rthb蛋白突变体进行了下述(1)-(4)中一个或两个以上位点的突变：
5、(1)seq id no:1所示氨基酸序列第16位的丙氨酸突变为精氨酸，即a16r，突变后的氨基酸序列为seq id no:3，核苷酸序列如seq id no:4所示；
6、(2)seq id no:1所示氨基酸序列第21位的甘氨酸突变为天冬氨酸，即g21d，突变后的氨基酸序列为seq id no:5。核苷酸序列如seq id no:6所示；
7、(3)seq id no:1所示氨基酸序列第117位的天冬酰胺突变为酪氨酸(n117y，突变后的氨基酸序列为seq id no:7。核苷酸序列如seq id no:8所示)，或突变为色氨酸(n117w，突变后的氨基酸序列为seq id no:9。核苷酸序列如seq id no:10所示)；
8、(4)seq id no:1所示氨基酸序列第156位的丝氨酸突变为苯丙氨酸(s156f，突变后的氨基酸序列为seq id no:11，核苷酸序列如seq id no:12所示)，或突变为亮氨酸(s156l，突变后的氨基酸序列为seq id no:13，核苷酸序列如seq id no:14所示)，或突变为酪氨酸(s156y，突变后的氨基酸序列为seq id no:15，核苷酸序列如seq id no:16所示)。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述rthb蛋白突变体为下述之一：
10、(1)seq id no:1所示氨基酸序列第16位的丙氨酸突变为精氨酸(a16r)，突变后的氨基酸序列为seq id no:3，核苷酸序列如seq id no:4所示；
11、(2)seq id no:1所示氨基酸序列第21位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g21d)，突变后的氨基酸序列为seq id no:5，核苷酸序列如seq id no:6所示；
12、(3)seq id no:1所示氨基酸序列第117位的天冬酰胺突变为酪氨酸(n117y)，突变后的氨基酸序列为seq id no:7，核苷酸序列如seq id no:8所示；
13、(4)seq id no:1所示氨基酸序列第117位的天冬酰胺突变为色氨酸(n117w)，突变后的氨基酸序列为seq id no:9，核苷酸序列如seq id no:10所示；
14、(5)seq id no:1所示氨基酸序列第156位的丝氨酸突变为苯丙氨酸(s156f)，突变后的氨基酸序列为seq id no:11，核苷酸序列如seq id no:12所示；
15、(6)seq id no:1所示氨基酸序列第156位的丝氨酸突变为亮氨酸(s156l)，突变后的氨基酸序列为seq id no:13，核苷酸序列如seq id no:14所示；
16、(7)seq id no:1所示氨基酸序列第156位的丝氨酸突变为酪氨酸(s156y)，突变后的氨基酸序列为seq id no:15，核苷酸序列如seq id no:16所示。
17、上述rthb蛋白突变体由外排l-苏氨酸转变为外排l-异亮氨酸。
18、第二方面，本专利技术提供了一种编码上述rthb蛋白突变体的核酸分子。
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:4所示。
20、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:6所示。
21、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:8所示。
22、在本专利技术的一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:10、seqid no:12、seq id no:14或seq id no:16所示。
23、第三方面，本专利技术提供了一种含有编码上述rthb蛋白突变体的核酸分子的重组载体。
24、第四方面，本专利技术提供了一种表达上述rthb蛋白突变体的重组微生物。
25、进一步地，所述重组微生物含有编码上述rthb蛋白突变体的核酸分子或重组载体。
26、进一步地，所述重组微生物为表达上述rthb蛋白突变体的原核微生物或真核微生物。
27、在本专利技术的一种实施方式中，所述原核微生物为棒状杆菌或其亚种、或埃希氏菌。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RthB蛋白突变体，所述RthB蛋白突变体是将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列第16位、21位、117位、156位进行单突变或多位点突变获得的。
2.根据权利要求1所述的RthB蛋白突变体，其特征在于，所述RthB蛋白突变体进行了下述(1)-(4)中一个或两个以上位点的突变：
3.根据权利要求1所述的RthB蛋白突变体，其特征在于，所述RthB蛋白突变体为下述之一：
4.一种编码权利要求1-3任一项所述RthB蛋白突变体的核酸分子。
5.一种含有权利要求4所述核酸分子的重组载体。
6.一种表达权利要求1-3任一项所述RthB蛋白突变体的重组微生物。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物含有权利要求4所述核酸分子、或权利要求5所述重组载体；
8.权利要求1-3任一项所述RthB蛋白突变体、权利要求4所述核酸分子、或权利要求5所述重组载体在制备异亮氨酸生产菌中的应用。
9.权利要求1-3任一项所述RthB蛋白突变体、权利要求4所述核酸分子、权利要求5所
10.一种提高异亮氨酸产量的方法，其特征在于，所用菌株中含有权利要求1-3任一项所述RthB蛋白突变体。
...【技术特征摘要】
1.一种rthb蛋白突变体，所述rthb蛋白突变体是将seq id no:1所示氨基酸序列第16位、21位、117位、156位进行单突变或多位点突变获得的。
2.根据权利要求1所述的rthb蛋白突变体，其特征在于，所述rthb蛋白突变体进行了下述(1)-(4)中一个或两个以上位点的突变：
3.根据权利要求1所述的rthb蛋白突变体，其特征在于，所述rthb蛋白突变体为下述之一：
4.一种编码权利要求1-3任一项所述rthb蛋白突变体的核酸分子。
5.一种含有权利要求4所述核酸分子的重组载体。
6.一种表达权利要求1-3任一项所述rthb...
【专利技术属性】
技术研发人员：何苗，张彧，陈璐，
申请(专利权)人：安徽华恒生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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