【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，更具体地，本专利技术涉及羊膜上皮细胞的属性及体外扩增方法。
技术介绍
1、上皮间质转化(emt)、间质上皮转化(met)在生物进化、胚胎发育过程中具有至关重要的作用：emt推动了胚层的出现、以及向胚层动物(真后生动物)的进化过程；在胚胎发育过程中，不同胚层、不同组织器官的顺序发育均伴随着细胞的emt和met过程。此外，emt、met也参与了伤口愈合、纤维化、肿瘤细胞的恶性化及新的病灶部位的产生。目前，利用细胞系、发育系统和癌症模型的研究揭示了emt诱导表型的多样性，emt执行和调节的显著复杂性。然而，emt的研究仍停留在传统的发育、细胞和癌症生物学，为破解emt的复杂性和可塑性，应该在更广泛的概念范围内进行探索。
2、羊膜(amniotic membrane)是胎盘的最内层，位于胎儿绒毛膜的表面，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物，也是母体与胎儿间进行物质交换的重要组织。羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells，aecs)来源于羊膜上皮层，单层排列生长在面向羊水的一面。
3、羊膜作为胚胎外组织中的重要成员，是动物从水生环境向陆生环境进化过渡的一个重要里程碑，其结构简单，由羊膜上皮层、基底膜、致密基质层、成纤维细胞层和中间海绵层组成，其中包含两种细胞，分别是位于上皮层的羊膜上皮细胞(aecs)和位于成纤维细胞层的羊膜间充质细胞。此外，羊膜的发育路径短，羊膜上皮细胞是由胚胎发育过程中的上胚层来源的羊膜母细胞(amnioblast)发育而来，而羊膜间
4、由于羊膜上皮细胞(aecs)具有低免疫原性、良好的免疫调节能力及营养因子分泌能力，aecs已被广泛的应用于多项临床试验和临床研究中。然而，目前研究者对aecs的属性认识尚不明确，对其发育及体外培养过程中的增殖机制不清楚。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于明确羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells,aecs)的基本属性，其发育和体外培养扩增过程中的增殖机制；并且，基于此，本专利技术还提供了新的aecs体外扩增的培养工艺，为其临床应用提供强有力的理论支持及足够的细胞数量，制备再生医学或细胞治疗用组合物或移植物，且羊膜作为上皮间质转化(emt)研究模型为emt的研究提供了新途经。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种体外扩增羊膜上皮细胞的方法，所述方法包括：对羊膜上皮细胞进行细胞培养和传代；其中，在细胞发生上皮间质转化(emt)、进入部分上皮间质转化(pemt)状态(获得上皮间质可塑性)后，维持细胞上皮间质可塑性(emp)，使细胞处于pemt状态，维持细胞的扩增。
3、在一种或多种实施方式中，所述分离羊膜上皮细胞包括从组织分离新鲜的羊膜上皮细胞。
4、在一种或多种实施方式中，通过抑制tgfβ信号通路来维持细胞上皮间质可塑性(emp)，使其处于部分上皮间质转化(pemt)状态；较佳地，利用tgfβ信号通路抑制剂进行tgfβ信号通路的抑制，维持细胞上皮间质可塑性。
5、在一种或多种实施方式中，在羊膜上皮细胞培养的p0代后期、p1代或p2代、较佳地在p0代后期或p1代，起始进行tgfβ信号通路的抑制。
6、在一种或多种实施方式中，所述p0代后期是p0代起始培养后第7±2天(较佳地第7±1.5天，更佳地第7±1天或第7±0.5天)
7、在一种或多种实施方式中，所述p1代是原代细胞(prep0)起始培养后(p0)，传代1次增殖培养后获得的细胞(第1代)；所述p2代是原代细胞(prep0)起始培养后，传代2次增殖培养后获得的细胞(第2代)。
8、在一种或多种实施方式中，以不表达间质标志物cd90、cd105、高表达上皮标志物cd324、ck18、cd9的细胞为prep0代细胞，且细胞不表达多能性标志物oct4、nanog、sox2，不表达端粒酶tert和terc，细胞为成熟上皮细胞。
9、在一种或多种实施方式中，以cd90阳性率＞2％表示发生了emt，进入了pemt状态。
10、在一种或多种实施方式中，所述羊膜上皮细胞为人源、哺乳动物来源的细胞(如非人灵长类动物来源、啮齿类动物来源的细胞)。
11、在一种或多种实施方式中，所述细胞培养和传代中，先进行培养以形成铺路石形貌；然后在培养的第7～12天、更佳地每9～11天进行一次传代；之后每5～12天、较佳地每6～10天、更佳地每7～9天进行一次传代。
12、在一种或多种实施方式中，进行如下的分阶段培养：(i)原代细胞(prep0)起始培养，使细胞形成铺路石形貌(p0)后传代(p1)；(ii)添加所述tgfβ信号通路抑制剂，进行培养；待形成铺路石形貌后传代(p1代起始，持续添加)。
13、在一种或多种实施方式中，进行如下的分阶段培养：(i')原代细胞起始培养，培养第7±2天添加所述tgfβ信号通路抑制剂，继续培养，待细胞形成铺路石形貌后传代；(ii')继续添加所述tgfβ信号通路抑制剂，进行培养；待形成铺路石形貌后传代。
14、在一种或多种实施方式中，所述tgfβ通路抑制剂包括：sb431542，repsox。
15、在一种或多种实施方式中，在培养体系中，所述sb431542的添加量为0.3～10μm；更佳地为0.5～6μm(如0.8，1，1.2，1.5，2，3，4，5μm)；更佳地1～2μm。
16、在一种或多种实施方式中，在培养体系中，所述repsox的添加量为0.15～5μm；更佳地为0.25～3μm(如0.4，0.5，0.6，0.8，1，1.5，2，2.5μm)；更佳地0.25～1μm。
17、在一种或多种实施方式中，进行细胞培养和传代过程中，采用低密度细胞接种；如，细胞接种密度为0.5*104/cm2～5*104/cm2；较佳地，细胞接种密度为1*104/cm2～4*104/cm2；更佳地，细胞接种密度为1.5*104/cm2～3.5*104/cm2(如2*104/cm2、3*104/cm2)。
18、在一种或多种实施方式中，初代以及传代培养中，每代细胞形成铺路石形貌后，进行传代培养。
19、在一种或多种实施方式中，低密度接种培养以mq1培养基(如培养5～10天、更佳地每6～9天或7～8天)和mq2培养基(如培养2～4天)培养，形成铺路石形貌。
20、在一种或多种实施方式中，所述mq1培养基包括(按照体积比)：基础培养基，1％左旋谷氨酰胺溶液，1％ mem neaa溶液，1％丙酮酸钠溶液，13.76iu/ml egf，5.0％ cts ksr；其中，各本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种体外扩增羊膜上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：对羊膜上皮细胞进行细胞培养和传代；其中，在细胞发生上皮间质转化、进入部分上皮间质转化状态后，维持细胞上皮间质可塑性，使细胞处于pEMT状态，维持细胞的扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过抑制TGFβ信号通路来维持细胞上皮间质可塑性，使其处于部分上皮间质转化状态；较佳地，利用TGFβ信号通路抑制剂进行TGFβ信号通路的抑制，维持细胞上皮间质可塑性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在羊膜上皮细胞培养的P0代后期、P1代或P2代、较佳地在P0代后期或P1代，起始进行TGFβ信号通路的抑制；较佳地，所述P0代后期是P0代起始培养后第7±2天。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述细胞培养和传代中，先进行培养以形成铺路石形貌；然后在培养的第7～12天、更佳地每9～11天进行一次传代；之后每5～12天、较佳地每6～10天、更佳地每7～9天进行一次传代。
5.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，进行如下的分阶段培养：
6.如
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进行细胞培养和传代过程中，采用低密度细胞接种；如，细胞接种密度为0.5*104/cm2～5*104/cm2；较佳地，细胞接种密度为1*104/cm2～4*104/cm2；更佳地，细胞接种密度为1.5*104/cm2～3.5*104/cm2。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以标志分子来确定细胞发生上皮间质转化、进入部分上皮间质转化状态；所述标志分子包括：上皮标志分子和间质标志分子，所述上皮标志分子包括CD326，CD9；所述间质标志分子包括CD90，Vimentin；
9.权利要求1～8任一所述的方法的应用，用于体外扩增羊膜上皮细胞；较佳地，所述羊膜上皮细胞应用于：
10.一种TGFβ信号通路抑制剂的用途，用于抑制TGFβ通路、维持羊膜上皮细胞上皮间质可塑性、维持羊膜上皮细胞处于部分上皮间质转化状态；或，用于制备抑制TGFβ信号通路、维持羊膜上皮细胞上皮间质可塑性、维持羊膜上皮细胞处于部分上皮间质转化状态的组合物。
...【技术特征摘要】
1.一种体外扩增羊膜上皮细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：对羊膜上皮细胞进行细胞培养和传代；其中，在细胞发生上皮间质转化、进入部分上皮间质转化状态后，维持细胞上皮间质可塑性，使细胞处于pemt状态，维持细胞的扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过抑制tgfβ信号通路来维持细胞上皮间质可塑性，使其处于部分上皮间质转化状态；较佳地，利用tgfβ信号通路抑制剂进行tgfβ信号通路的抑制，维持细胞上皮间质可塑性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在羊膜上皮细胞培养的p0代后期、p1代或p2代、较佳地在p0代后期或p1代，起始进行tgfβ信号通路的抑制；较佳地，所述p0代后期是p0代起始培养后第7±2天。
4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述细胞培养和传代中，先进行培养以形成铺路石形貌；然后在培养的第7～12天、更佳地每9～11天进行一次传代；之后每5～12天、较佳地每6～10天、更佳地每7～9天进行一次传代。
5.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，进行如下的分阶段培养：
6.如权利要求1～3任...
【专利技术属性】
技术研发人员：何志颖，郝王平，张文成，张传宇，罗以，鲁岳峰，崔洋洋，
申请(专利权)人：上海赛傲生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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