【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、先导编辑是一种基因编辑技术，允许研究人员在细胞dna中进行核苷酸取代、插入、删除或其组合。先导编辑可用于纠正疾病相关基因突变，并且可用于治疗具有遗传组分的疾病。需要具有期望特性(诸如以改进的效率促进先导编辑的能力)的改进的先导pegrna。
技术实现思路
1、本文提供了可用于先导编辑的先导编辑指导rna(pegrna)，以及使用和制造此类pegrna的方法。
2、在一些方面，本文提供了先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：(a)间隔区，其包含与双链靶dna的靶链中的搜索靶序列互补的区域；(b)指导rna(grna)核心，其能够结合至cas蛋白；(c)延伸臂，其包含：(i)编辑模板，其与双链靶dna相比包含预期编辑，和(ii)引物结合位点(pbs)，其包含与双链靶dna的非靶链中的切口位点上游的区域互补的区域；以及(d)3'核酸基序，其选自由seq ref no 1-15组成的组。
3、在一些方面，本文还提供了先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：(a)间隔区，其包含与双链靶dna的靶链中的搜索靶序列互补的区域；(b)指导rna(grna)核心，其能够结合至cas蛋白；(c)延伸臂，其包含：(i)编辑模板，其与双链靶dna相比包含预期编辑，和(ii)引物结合位点(pbs)，其包含与双链靶dna的非靶链中的切口位点上游的区域互补的区域；以及(d)3'核酸基序，其中所述3'核酸基序包含选自由以下组成的组的序列：(a)来源于vegf基因启
4、在一些实施方案中，3'核酸基序是来源于vegf基因启动子的g-四链体或c-四链体(例如，其中g-四链体包含seq ref no:10和/或c-四链体包含seq ref no:11)。在一些实施方案中，3'核酸基序是来源于马铃薯卷叶病毒(plrv)的假结(例如，其中假结包含seq refno:4)。在一些实施方案中，3'核酸基序包含ms2蛋白结合序列(例如，其中ms2蛋白结合序列是seq ref no:9)。在一些实施方案中，3'核酸基序包含mmlv逆转录酶募集序列(例如，mmlv逆转录酶募集序列包含seq ref no:8)。在一些实施方案中，3'核酸基序包含mmlv复制识别序列。
5、在一些实施方案中，mmlv复制识别序列包含选自由seq refno:12-15组成的组的序列。在一些实施方案中，3'核酸基序包含seq ref no:1、2、3、5、6或7。
6、如本文所提供的，pegrna按5'到3'顺序包含间隔区、grna核心、编辑模板、pbs和3'核酸基序。在一些实施方案中，pegrna还包含紧接3'核酸基序的5'的接头。接头的长度可以是2至12个核苷酸，诸如长度是8个核苷酸。在一些实施方案中，接头不形成二级结构。在一些实施方案中，接头与pbs序列、编辑模板、支架和/或延伸臂不具有完全互补性。在一些实施方案中，接头与延伸臂具有不超过90％、不超过85％、不超过80％、不超过75％、不超过70％、不超过65％、不超过60％、不超过55％、不超过50％、不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％或不超过15％的互补性。
7、在一些方面，本文提供了先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：(a)间隔区，其包含与双链靶dna的靶链中的搜索靶序列互补的区域；(b)延伸臂，其包含：(i)编辑模板，其与双链靶dna相比包含预期编辑，和(ii)引物结合位点(pbs)，其包含与双链靶dna的非靶链中的切口位点上游的区域互补的区域；以及(c)指导rna(grna)核心，其与seq ref no:16具有至少80％同一性并且相对于seq ref no:16含有一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包括：(a)核苷酸12与13之间的第一插入和核苷酸16与17之间的第二插入，其中第一插入是第二插入的反向互补；(b)核苷酸52与53之间的第一插入和核苷酸56与57之间的第二插入，其中第一插入是第二插入的反向互补；(c)核苷酸2和29、3和28、4和27、51和58的互补取代，或其组合；(d)用替换序列1替换核苷酸11-12和用替换序列2替换核苷酸17-18，其中替换序列1的长度是至少3个核苷酸并且其中替换序列2是替换序列1的反向互补；(e)核苷酸5处的t到g取代或t到c取代和核苷酸26处的互补取代；或(f)其任何组合。
8、在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸12与13之间的第一插入和核苷酸16与17之间的第二插入。插入的长度可以是1至6个核苷酸。在一些实施方案中，第一插入包含序列ugcug。在一些实施方案中，第二插入包含序列cagca。
9、在一些实施方案中，一种或多种修饰包括用替换序列1替换核苷酸49-52和用替换序列2替换核苷酸57-60，其中替换序列2是替换序列1的反向互补；任选地，其中替换序列1的长度是7-11个核苷酸；任选地，其中替换序列1的长度是7-9个核苷酸；任选地，其中替换序列1包含gcgucuc、gcguccc、gcgucca、gcguguga、gcguagcc、gcgugcaga、gcguacccu或gcguugucg。
10、在一些实施方案中，第一插入的长度是1至3个核苷酸，例如，第一插入可包含选自由c、cc、ca、cg、a、ac、aa、ag、ccc、ccac、ccaac和ccacac组成的组的序列。
11、在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸52与53之间的第一插入和核苷酸56与57之间的第二插入。第一插入的长度可以是1至8个核苷酸。在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸2和29、3和28、4和27、11和18、12和17、51和58的互补取代，或其组合。在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸2处的u到a取代。在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸3处的u到a取代。在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸4处的u到a取代。在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸51处的u到g取代和任选核苷酸58处的a到c取代。
12、在一些实施方案中，grna核心包含用替换序列1替换核苷酸11-12和用替换序列2替换核苷酸17-18。
13、在一些实施方案中，替换序列1的长度是3至5个核苷酸，例如，替换序列1可包含选自由cagc、ccgc、ggac、ugc、ucc、gaggc、agc、ggc、cgca、gcaca、gguc和ggg组成的组中的序列。在一些实施方案中，grna核心还包含核苷酸5处的u到a取代和核苷酸26处的a到u取代。在一些实施方案中，grna核心包含核苷酸52和57处的互补取代。在一些实施方案中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种先导编辑指导RNA(PEgRNA)，其包含：
2.一种先导编辑指导RNA(PEgRNA)，其包含：
3.如权利要求2所述的PEgRNA，其中选定的3'核酸基序是所述来源于VEGF基因启动子的G-四链体或C-四链体。
4.如权利要求3所述的PEgRNA，其中所述G-四链体包含SEQ REF NO:10。
5.如权利要求3所述的PEgRNA，其中所述C-四链体包含SEQ REF NO:11。
6.如权利要求2所述的PEgRNA，其中所述选定的3'核酸基序是所述来源于马铃薯卷叶病毒(PLRV)的假结。
7.如权利要求6所述的PEgRNA，其中所述假结包含SEQ REFNO:4。
8.如权利要求2所述的PEgRNA，其中所述选定的3'核酸基序包含所述MS2蛋白结合序列。
9.如权利要求8所述的PEgRNA，其中所述MS2蛋白结合序列是SEQ REF NO:9。
10.如权利要求2所述的PEgRNA，其中所述选定的3'核酸基序包含所述MMLV逆转录酶募集序列。
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12.如权利要求2所述的PEgRNA，其中所述选定的3'核酸基序包含MMLV复制识别序列。
13.如权利要求12所述的PEgRNA，其中所述MMLV复制识别序列包含选自由SEQ REF NO:12-15组成的组的序列。
14.如权利要求1所述的PEgRNA，其中所述3'核酸基序包含SEQ REF NO:1、2、3、5、6或7。
15.如权利要求1-14中任一项所述的PEgRNA，其中所述PEgRNA按5'到3'顺序包含所述间隔区、所述gRNA核心、所述编辑模板、所述PBS和所述3'核酸基序。
16.如权利要求1至15中任一项所述的PEgRNA，其中所述PEgRNA还包含紧接所述3'核酸基序的5'的接头。
17.如权利要求16所述的PEgRNA，其中所述接头的长度是2至12个核苷酸。
18.如权利要求17所述的PEgRNA，其中所述接头的长度是8个核苷酸。
19.如权利要求16至18中任一项所述的PEgRNA，其中所述接头不形成二级结构。
20.如权利要求16至19中任一项所述的PEgRNA，其中所述接头与所述PBS序列不具有完全互补性。
21.如权利要求16至20中任一项所述的PEgRNA，其中所述接头与所述编辑模板不具有完全互补性。
22.如权利要求16至21中任一项所述的PEgRNA，其中所述接头与所述支架不具有完全互补性。
23.如权利要求16至22中任一项所述的PEgRNA，其中所述接头与所述延伸臂不具有完全互补性。
24.如权利要求16-23中任一项所述的PEgRNA，其中所述接头与所述延伸臂具有不超过90％、不超过85％、不超过80％、不超过75％、不超过70％、不超过65％、不超过60％、不超过55％、不超过50％、不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％或不超过15％的互补性。
25.一种先导编辑指导RNA(PEgRNA)，其包含：
26.如权利要求25所述的PEgRNA，其中所述gRNA核心包含(i)所述核苷酸12与13之间的第一插入和所述核苷酸16与17之间的第二插入。
27.如权利要求26所述的PEgRNA，其中所述第一插入的长度是1至6个核苷酸。
28.如权利要求25所述的PEgRNA，其中所述第一插入包含所述序列UGCUG。
29.如权利要求26所述的PEgRNA，其中所述第二插入包含所述序列CAGCA。
30.如权利要求26所述的PEgRNA，其中所述第一插入的长度是1至3个核苷酸。
31.如权利要求30所述的PEgRNA，其中所述第一插入包含选自由C、CC、CA、CG、A、AC、AA、AG、CCC、CCAC、CCAAC和CCACAC组成的组的序列。
32.如权利要求25所述的PEgRNA，其中所述gRNA核心包含所述核苷酸52与53之间的第一插入和所述核苷酸56与57之间的第二插入。
33.如权利要求32所述的PEgRNA，其中所述第一插入的长度是1至8个核苷酸。
34.如权利要求25所述的PEgRNA，其中所述gRNA核心包含所述核苷酸2和29、3和28、4和27、11和18、12和17、51和58的互...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：
2.一种先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：
3.如权利要求2所述的pegrna，其中选定的3'核酸基序是所述来源于vegf基因启动子的g-四链体或c-四链体。
4.如权利要求3所述的pegrna，其中所述g-四链体包含seq ref no:10。
5.如权利要求3所述的pegrna，其中所述c-四链体包含seq ref no:11。
6.如权利要求2所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序是所述来源于马铃薯卷叶病毒(plrv)的假结。
7.如权利要求6所述的pegrna，其中所述假结包含seq refno:4。
8.如权利要求2所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序包含所述ms2蛋白结合序列。
9.如权利要求8所述的pegrna，其中所述ms2蛋白结合序列是seq ref no:9。
10.如权利要求2所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序包含所述mmlv逆转录酶募集序列。
11.如权利要求10所述的pegrna，其中所述mmlv逆转录酶募集序列包含seq ref no:8。
12.如权利要求2所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序包含mmlv复制识别序列。
13.如权利要求12所述的pegrna，其中所述mmlv复制识别序列包含选自由seq ref no:12-15组成的组的序列。
14.如权利要求1所述的pegrna，其中所述3'核酸基序包含seq ref no:1、2、3、5、6或7。
15.如权利要求1-14中任一项所述的pegrna，其中所述pegrna按5'到3'顺序包含所述间隔区、所述grna核心、所述编辑模板、所述pbs和所述3'核酸基序。
16.如权利要求1至15中任一项所述的pegrna，其中所述pegrna还包含紧接所述3'核酸基序的5'的接头。
17.如权利要求16所述的pegrna，其中所述接头的长度是2至12个核苷酸。
18.如权利要求17所述的pegrna，其中所述接头的长度是8个核苷酸。
19.如权利要求16至18中任一项所述的pegrna，其中所述接头不形成二级结构。
20.如权利要求16至19中任一项所述的pegrna，其中所述接头与所述pbs序列不具有完全互补性。
21.如权利要求16至20中任一项所述的pegrna，其中所述接头与所述编辑模板不具有完全互补性。
22.如权利要求16至21中任一项所述的pegrna，其中所述接头与所述支架不具有完全互补性。
23.如权利要求16至22中任一项所述的pegrna，其中所述接头与所述延伸臂不具有完全互补性。
24.如权利要求16-23中任一项所述的pegrna，其中所述接头与所述延伸臂具有不超过90％、不超过85％、不超过80％、不超过75％、不超过70％、不超过65％、不超过60％、不超过55％、不超过50％、不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％或不超过15％的互补性。
25.一种先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：
26.如权利要求25所述的pegrna，其中所述grna核心包含(i)所述核苷酸12与13之间的第一插入和所述核苷酸16与17之间的第二插入。
27.如权利要求26所述的pegrna，其中所述第一插入的长度是1至6个核苷酸。
28.如权利要求25所述的pegrna，其中所述第一插入包含所述序列ugcug。
29.如权利要求26所述的pegrna，其中所述第二插入包含所述序列cagca。
30.如权利要求26所述的pegrna，其中所述第一插入的长度是1至3个核苷酸。
31.如权利要求30所述的pegrna，其中所述第一插入包含选自由c、cc、ca、cg、a、ac、aa、ag、ccc、ccac、ccaac和ccacac组成的组的序列。
32.如权利要求25所述的pegrna，其中所述grna核心包含所述核苷酸52与53之间的第一插入和所述核苷酸56与57之间的第二插入。
33.如权利要求32所述的pegrna，其中所述第一插入的长度是1至8个核苷酸。
34.如权利要求25所述的pegrna，其中所述grna核心包含所述核苷酸2和29、3和28、4和27、11和18、12和17、51和58的互补取代，或其组合。
35.如权利要求34所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸2处的u到a取代。
36.如权利要求34所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸3处的u到a取代。
37.如权利要求34所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸4处的u到a取代。
38.如权利要求34所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸51处的u到g取代和任选地核苷酸58处的a到c取代。
39.如权利要求25所述的pegrna，其中所述grna核心包含用所述替换序列1替换核苷酸11-12和用所述替换序列2替换核苷酸17-18。
40.如权利要求39所述的pegrna，其中所述替换序列1的长度是3至5个核苷酸。
41.如权利要求40所述的pegrna，其中所述替换序列1包含选自由cagc、ccgc、ggac、ugc、ucc、gaggc、agc、ggc、cgca、gcaca、gguc和ggg组成的组的序列。
42.如权利要求26-41中任一项所述的pegrna，其中所述grna核心还包含核苷酸5处的u到a取代和核苷酸26处的a到u取代。
43.如权利要求25-42中任一项所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸52和57处的互补取代。
44.如权利要求43所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸52处的u到g取代和核苷酸57处的a到c取代。
45.如权利要求43所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸52处的u到c取代和核苷酸57处的a到g取代。
46.如权利要求25-45中任一项所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸49和60处的互补取代。
47.如权利要求46所述的pegrna，其中所述grna核心包含核苷酸49处的a到g取代和核苷酸60处的u到c取代。
48.一种先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：
49.如权利要求25-48中任一项所述的pegrna，其中所述grna核心包含seq ref no:16的核苷酸62-76。
50.一种先导编辑指导rna(pegrna)，其包含：
51.如权利要求50所述的pegrna，其中所述grna核心包含选自由seq ref no:4294、4319、4322、4286、4290、4346、4271、4264、4317、4330、4312、4356、4280和4452组成的组的序列。
52.如权利要求50所述的pegrna，其中所述grna核心包含seq ref no:4354。
53.如权利要求25-52中任一项所述的pegrna，其还包含：(d)选自由seq ref no 1-15组成的组的3'核酸基序。
54.如权利要求53所述的pegrna，其中所述3'核酸基序包含seq ref no:1、2、3、5、6或7。
55.如权利要求25-52中任一项所述的pegrna，其还包含：(d)3'核酸基序，其中所述3'核酸基序包含选自由以下组成的组的序列：
56.如权利要求55所述的pegrna，其中选定的3'核酸基序是所述来源于vegf基因启动子的g-四链体或c-四链体。
57.如权利要求56所述的pegrna，其中所述g-四链体包含seq ref no:10。
58.如权利要求56所述的pegrna，其中所述c-四链体包含seq ref no:11。
59.如权利要求55所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序是所述来源于马铃薯卷叶病毒(plrv)的假结。
60.如权利要求59所述的pegrna，其中所述假结包含seq refno:4。
61.如权利要求55所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序包含所述ms2蛋白结合序列。
62.如权利要求61所述的pegrna，其中所述ms2蛋白结合序列是seq ref no:9。
63.如权利要求55所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序包含所述mmlv逆转录酶募集序列。
64.如权利要求63所述的pegrna，其中所述mmlv逆转录酶募集序列包含seq ref no:8。
65.如权利要求55所述的pegrna，其中所述选定的3'核酸基序包含mmlv复制识别序列。
66.如权利要求65所述的pegrna，其中所述mmlv复制识别序列包含选自由seq ref no:12-15组成的组的序列。
【专利技术属性】
技术研发人员：A·V·安扎隆，J·施蒂勒，D·威利，
申请(专利权)人：先导药物有限公司，
类型：发明
国别省市：
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