【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及外周神经病理性疼痛，具体为一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用。
技术介绍
1、随着全球老龄化加剧、糖尿病发病率增高和癌症化疗增多等各种原因，全球的神经病理性疼痛患者愈加增多，2008年国际疼痛协会iasp定义由躯体感觉系统损伤或疾病引起的疼痛为np，np大约影响着6.9％至10％的世界人口，是使患者产生经济负担的全球性疾病之一，发病率逐年增多，且具有年轻化趋势，严重影响患者的生活质量和工作效率，对患者本人和家庭造成了沉重的生理和心理负担，np属于慢性反复发作的疼痛性疾病，是神经系统对损伤适应不良的结果，常继发于神经系统的直接损害或功能障碍，如神经、脊髓或脑部创伤，或与糖尿病、感染、多发性硬化、癌症以及化疗药物等相关，其主要临床表现为痛觉过敏、痛觉超敏和自发性疼痛，至今临床上np的主要疗法还是药物治疗，常采用抗癫痫药、抗抑郁药、非甾体抗炎药、抗惊厥药、阿片类镇痛药和天门冬氨酸拮抗剂等，其中一线治疗药物加巴喷丁和度洛西汀等，以及非一线的拉莫三嗪和限用于三叉神经痛的卡马西平都属于离子通道药物，np痛感剧烈，目前使用的药物治疗效果不佳，可能是由于主要缓解疼痛症状而未减少外周神经的损伤，并且大部分药物具有较多的不良反应，为实现np治疗效果的提高，结合制定个体化np治疗方案的社会需求，亟需研发具有更加有效作用靶点、作用途径和副作用小的新型药物，为此需要研究调节坐骨神经cci雄性大鼠bnst脑区的cd73-腺苷-a1ar腺苷信号对np的影响，探索完善np中枢调控机制。
技术实现思路>
1、本专利技术的目的在于提供一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，以解决上述
技术介绍
中提出的目前使用的药物治疗效果不佳，可能是由于主要缓解疼痛症状而未减少外周神经的损伤，并且大部分药物具有较多的不良反应，为实现np治疗效果的提高，结合制定个体化np治疗方案的社会需求，亟需研发具有更加有效作用靶点、作用途径和副作用小的新型药物，为此需要研究调节坐骨神经cci雄性大鼠bnst脑区的cd73-腺苷-a1ar腺苷信号对np的影响，探索完善np中枢调控机制的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，包括以下步骤方法：
3、s1、饲养48只180-220g健康未交配雄性sd大鼠随机分八组；
4、s2、假手术对照神经元型腺苷探针(sham neuado+con)组、坐骨神经结扎(chronicconstriction injury，cci)模型神经元型腺苷探针(cci neuado+veh)组、a1ar拮抗剂dpcpx神经元型腺苷探针(cci neuado+prog+dpcpx)组、prog治疗神经元型腺苷探针(cci neuado+prog)组，以及假手术对照星形胶质细胞型腺苷探针组(sham astado+con)组、模型星形胶质细胞型腺苷探针(cci astado+veh)组、a1ar拮抗剂星形胶质细胞型腺苷探针(cciastado+prog+dpcpx)组、prog治疗星形胶质细胞型腺苷探针(cci astado+prog)组；
5、s3、测定大鼠mwt和twl的基础值；
6、s4、麻醉大鼠后，前四组在bnst注射神经元型腺苷探针raav-hsyn-ado_b10-wpre-hghpa，后四组在bnst注射星胶型腺苷探针raav-gfaabc1d-ado_b10，立体定位注射坐标为：前囟后ap-0.15，中线旁开ml±2.65，距顶部硬脑膜深度dv-5.85mm；同时进行大鼠右后肢cci；
7、s5、从结扎后第14天开始连续两周给药，每日一次，前后各四组大鼠分别腹腔给予溶剂、溶剂、dpcpx(2mg·kg-1)(提前半小时注射)+prog(12mg·kg-1)、prog(12mg·kg-1)，在结扎第3周时，进行bnst埋置光纤；
8、s6、在腺苷探针表达四周、坐骨神经结扎28天即给药两周后，先测定各组mwt和twl；再使用光纤记录系统采集各组动物在受到机械刺激或热刺激时bnst脑区内的腺苷信号变化；
9、s7、每组1只大鼠4％多聚甲醛灌注固定，取脑进行冠状冰冻切片，镜下观察腺苷探针表达区域和光纤置入位置，每组另1只大鼠麻醉后即刻取脑，震荡切片，进行膜片钳检测，电生理记录bnst腺苷探针转染细胞的放电类型(神经元型探针的四组动物)及iv曲线(星胶型探针的四组动物)；
10、s8、每组4只大鼠深麻醉后断头取脑，切取bnst新鲜脑组织，液氮速冻，以备进行westernblot检测用；
11、s9、利用以上描述方法以及实验数据进行cci模型动物表达腺苷探针、痛觉刺激时腺苷信号的监测以及行为学测定后的取材检测。
12、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：对于cci致np的动物模型，脑区终纹床核(bed nuclei of the stria terminals，bnst)功能与雄性大鼠外周np的调节有关，而在外周热痛刺激可以引起bnst腺苷水平明显变化，外周机械刺激未引起，并且全身给予神经类固醇黄体酮(progesterone，prog)治疗外周np时，通过调控bnst的细胞外-5’-核苷酸酶(ecto-5’nucleotidase，cd73)-腺苷-a1腺苷受体(a1 adenosine receptor，a1ar)腺苷信号通路，可以促进np康复，改善机械性缩足阈值(mechanicalwithdrawal threshold，mwt)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawallatency，twl)，并且与该脑区腺苷水平负相关，与a1ar含量变化正相关，调控bnst的cd73-腺苷-a1ar腺苷信号通路作为新的一种外周np动物模型中枢治疗机制，测定该脑区腺苷水平和a1ar含量作为这种治疗机制的评价方法
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1.一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于，包括以下步骤方法：
2.根据权利要求1所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述S1步骤中饲养大鼠的室温维持在22-26℃、湿度55±10％，可控式12/12h光照周期(光照时间8：OOAM～20：00PM)，自由摄水摄食，且动物行为学检测均在光照期间进行。
3.根据权利要求2所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述S1步骤中实验前动物适应环境，在未进行第一次基础行为学测定的前三天每天将大鼠分别放置于实验台中30min，等待大鼠洗脸、搔抓、直立、行走等活动完全停止，处于安静状态时止，筛选剔除30min内仍然无法处于安静状态的大鼠，并将筛选出的48只大鼠按照随机数字表分成八个小组，每小组6只，经前期预实验，腺苷对照探针和腺苷探针分别在大鼠单侧BNST表达后，MWT和TWL之间无显著差异，因而探针溶剂对疼痛行为无显著影响，按照动物实验的3R原则，实验中不再设置腺苷探针对照组。
4.根据权利要求3所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特
5.根据权利要求4所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述结扎术前1天、术后第7、14、21和第28天，检测大鼠MWT，实验时将大鼠置于架高的距离实验台50cm的透明有机玻璃罩内(18×25×18cm)，底部为用金属丝制成的镂空网格垫(0.8×0.8cm)，测试前让大鼠在玻璃罩内适应30min，此期间大鼠活动较多，经常会有便溺行为，测试前清理网格上的粪便；到30min后，用ElectronicVonFrey触觉自动测痛仪垂直刺激大鼠坐骨神经结扎侧即右后足的底部中间区域，逐渐用力加压，待大鼠有明确反应(如舔足，突然收缩，或抖足等)时，记录当时液晶显示器上的数字即当次测试的最大压力，该读数为该次的MWT值，刺激大鼠右后足底部中间区域最大施加力度为55g，每只大鼠的下一次测试距离前一次测试至少间隔10min，即等待刺激引起的行为反应(如舔足等)完全消失后再给予下一次刺激，获得3次测试的MWT平均值。
6.根据权利要求5所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述为给各组大鼠BNST注射相应的腺苷AAV，将大鼠置于有废气回收剂的密闭亚克力小箱内，通入2％异氟烷至大鼠翻正反射消失，夹尾也无反应后，给大鼠头顶部剃毛，双眼涂抹红霉素眼膏，通过耳杆将大鼠固定于脑立体位仪上，并用面罩提供1.0％异氟烷进行麻醉维持(异氟烷浓度随手术操作过程中大鼠的疼痛反应进行调整)，用碘酒消毒大鼠两耳及两眼平行连线形成的梯形区域，皮下注射0.2mL2％利多卡因，沿头颅矢状线剪开头皮、暴露颅骨，去除骨膜直至颅骨缝清晰可见，然后，利用固定在夹持器上的玻璃电极尖端进行颅骨表面调平，即以前囟(Bregma)作为立体定位的原点(AP＝0mm，ML＝0mm，DV＝0mm)，通过调节门齿高度使后囟(Lambda)与Bregma水平(偏差小于0.01mm)，通过左右调平使矢状缝两侧等距离的位点(AP＝0mm，ML＝±2.0mm)处于同一水平面(偏差小于0.01mm)，其次，根据大鼠脑图谱(6th Editonby Paxinosand Watson)和文献报道，用装有墨汁的玻璃电极的尖端标记目的脑区对应的颅骨表面，并用颅钻在标记点打孔暴露硬脑膜，打孔直径达到连接注射玻璃电极穿过时所需的孔径区域，接着，连接于微量注射泵的微量注射器尖端套接玻璃电极并密封好缝隙，吸入300nl AAV探针，按三维立体定位坐标-0.15mm(距离前囟后)、±2.65mm(颅骨中线旁开)和-5.85mm(距离硬脑膜深度)，均匀慢速置入目标脑区，以10n1/min的速度缓慢注入，注射完毕停留5min，缓慢退针0.05mm时再停留5min，再缓缓将连接微量注射器的玻璃电极拔出脑组织，最后，缝合切口处头皮，涂抹红霉素软膏。
7.根据权利要求6所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述在腺苷AAV注射并表达四周，即结扎术间隔两周后连续给予药物两周后，在术后第28天给药、序贯测试完MWT和TWL后，将第二组和第三组的大鼠放置于光纤记录仪房间适应至少1h，同时设置光纤记录仪参数，将光纤跳线连接到光纤记录仪进行基线漂白，然后将大鼠依次放置于热痛测试盒内，然后...
【技术特征摘要】
1.一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于，包括以下步骤方法：
2.根据权利要求1所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述s1步骤中饲养大鼠的室温维持在22-26℃、湿度55±10％，可控式12/12h光照周期(光照时间8：ooam～20：00pm)，自由摄水摄食，且动物行为学检测均在光照期间进行。
3.根据权利要求2所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述s1步骤中实验前动物适应环境，在未进行第一次基础行为学测定的前三天每天将大鼠分别放置于实验台中30min，等待大鼠洗脸、搔抓、直立、行走等活动完全停止，处于安静状态时止，筛选剔除30min内仍然无法处于安静状态的大鼠，并将筛选出的48只大鼠按照随机数字表分成八个小组，每小组6只，经前期预实验，腺苷对照探针和腺苷探针分别在大鼠单侧bnst表达后，mwt和twl之间无显著差异，因而探针溶剂对疼痛行为无显著影响，按照动物实验的3r原则，实验中不再设置腺苷探针对照组。
4.根据权利要求3所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述假手术对照神经元型腺苷探针(sham neuado+con)组：bnst脑区注射raav-hsyn-ado_b10-wpre-hghpa腺苷探针，只进行剃毛、切皮，暴露右后肢坐骨神经，不进行结扎，腹腔注射只含10％玉米油+10％dmso+10％(v/v)乙醇的生理盐水；
5.根据权利要求4所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述结扎术前1天、术后第7、14、21和第28天，检测大鼠mwt，实验时将大鼠置于架高的距离实验台50cm的透明有机玻璃罩内(18×25×18cm)，底部为用金属丝制成的镂空网格垫(0.8×0.8cm)，测试前让大鼠在玻璃罩内适应30min，此期间大鼠活动较多，经常会有便溺行为，测试前清理网格上的粪便；到30min后，用electronicvonfrey触觉自动测痛仪垂直刺激大鼠坐骨神经结扎侧即右后足的底部中间区域，逐渐用力加压，待大鼠有明确反应(如舔足，突然收缩，或抖足等)时，记录当时液晶显示器上的数字即当次测试的最大压力，该读数为该次的mwt值，刺激大鼠右后足底部中间区域最大施加力度为55g，每只大鼠的下一次测试距离前一次测试至少间隔10min，即等待刺激引起的行为反应(如舔足等)完全消失后再给予下一次刺激，获得3次测试的mwt平均值。
6.根据权利要求5所述的一种外周神经病理性疼痛中枢治疗的判断应用，其特征在于：所述为给各组大鼠bnst注射相应的腺苷aav，将大鼠置于有废气回收剂的密闭亚克力小箱内，通入2％异氟烷至大鼠翻正反射消失，夹尾也无反应后，给大鼠头顶部剃毛，双眼涂抹红霉素眼膏，通过耳杆将大鼠固定于脑立体位仪上，并用面罩提供1.0％异氟烷进行麻醉维持(异氟烷浓度随手术操作过程中大鼠的疼痛反应进行调整)，用碘酒消毒大鼠两耳及两眼平行连线形成的梯形区域，皮下注射0.2ml2％利多卡因，沿头...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏颖，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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