【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及一种生产β-烟酰胺核糖的基因工程菌株及其应用，以及一种生产β-烟酰胺核糖的方法。
技术介绍
1、β-烟酰胺核糖(β-nicotinamide riboside，β-nr或nr)是维生素b3的衍生物，可以作为哺乳动物体内辅酶i——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide，nad+)的合成前体，在烟酰胺核糖激酶(nrk)的作用下转化为β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononuclotide，β-nmn或nmn)，并最终合成nad+。nad+是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于nad+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。研究已证明口服补充nr可增加多种组织中的nad+水平，改善线粒体功能和干细胞的再生潜力，对心血管疾病、神经退行性疾病和代谢疾病有治疗作用，并且具有较高的生物利用度和安全性，因此nr可以用作一种营养补充剂或保健品原料。nr还可以添加到护肤品中，用于改善老年斑以及皮肤的总体增亮，缓解炎症、皱纹和环境压力造成的皮肤问题等。
2、
3、目前，nr的生产主要采用化学合成法，如利用三氟甲磺酸三甲基硅脂(tmsotf)催化反应等，但化学合成法往往工艺较为复杂，产物构型控制和纯化的难度大，且可能产生较高的生产成本和潜在的环境污染；而重组微生物发酵法通过在微生物菌株内构建生物合成途径实现nr的生产，具有成本低廉、操作便捷、转
4、cn113528562b提供了一种生产β-烟酰胺核糖的重组微生物的构建和应用方法。该专利技术通过在大肠杆菌(escherichia coli)w3110(atcc27325)中敲除与降解和利用nmn、消耗底物烟酰胺(nicotinamide，nam)和降解产物nr有关的基因构建出发菌株sha04k，在此基础上敲除了核糖核苷水解酶基因riha和rihc得到重组菌株shq05c(保藏编号为cgmccno.22633)。在shq05c中表达能将nmn转化为nr的5'-核苷酸酶usha，可利用nam发酵得到近300mg/l nr，共表达具有200-300个拷贝的usha高表达质粒后摇瓶发酵产量可达到520mg/l。
5、cn114854656a公开了一种可利用nam合成nr的重组菌。该专利技术以重组大肠杆菌f004(e.coli bl21(de3),δpncc、δusha、δnadr、δpurr)为出发菌株，敲除与nr降解和转运相关的基因deod、pnuc、rihabc，通过质粒引入烟酰胺磷酸核糖基转移酶vpnadv和磷酸核糖焦磷酸(prpp)合酶baprs，并过表达5'-核苷酸酶usha和nad+衍生物转运蛋白bmpnuc，获得重组菌株nr010。优化摇瓶发酵条件后，nr010的nr产量为1096mg/l。若不过表达bmpnuc，nr产量可达到1610mg/l。
6、以上方法发酵产量仍有提高的空间。因此，仍然需要开发更高效的利用重组微生物发酵生产nr的方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中nr合成发酵产量低的缺陷，提供一种生产β-烟酰胺核糖的基因工程菌株及其应用，以及一种生产β-烟酰胺核糖的方法。利用本专利技术提供的基因工程菌株以及本专利技术提供的方法生产β-烟酰胺核糖具有发酵高效且产量高的优势。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一为：一种基因工程菌株，所述基因工程菌株为在保藏编号为cctcc m2022922的出发菌株中过表达5'-核苷酸酶基因usha。
3、在本专利技术的具体实施方案中，所述过表达5'-核苷酸酶基因usha为向所述出发菌株中转入usha表达质粒。
4、在本专利技术的具体实施方案中，所述usha表达质粒的质粒骨架载体为pcdfduet-1。
5、在本专利技术的具体实施方案中，所述usha的核苷酸序列如seq id no:1所示。
6、在本专利技术的具体实施方案中，所述基因工程菌株编码核糖核苷水解酶的基因riha、rihb和rihc中的一个或多个被敲除或突变以使所述核糖核苷水解酶不表达或酶活降低。
7、在本专利技术的具体实施方案中，所述riha、rihb和rihc的核苷酸序列满足以下条件的一个或多个：
8、(1)所述riha的核苷酸序列如seq id no:2所示；
9、(2)所述rihb的核苷酸序列如seq id no:3所示；
10、(3)所述rihc的核苷酸序列如seq id no:4所示。
11、在本专利技术的具体实施方案中，用于敲除所述riha、rihb和rihc中一个或多个的敲除质粒的骨架载体为ptargetf。
12、在本专利技术的具体实施方案中，所述基因工程菌株编码6-磷酸果糖激酶i的基因pfka被敲除或突变以使所述6-磷酸果糖激酶i不表达或酶活降低，所述pfka的核苷酸序列优选如seq id no:5所示；和/或，所述基因工程菌株过表达果糖-1,6-二磷酸酶i基因fbp，所述fbp的核苷酸序列优选如seq id no:6所示。
13、在本专利技术的具体实施方案中，所述过表达果糖-1,6-二磷酸酶i基因fbp为向所述基因工程菌株的基因组中插入fbp基因。
14、在本专利技术的具体实施方案中，在敲除所述pfka的同时，在pfka被敲除的位点引入fbp；用于敲除所述pfka的敲除质粒的骨架载体优选ptargetf。
15、在本专利技术的具体实施方案中，所述基因工程菌株的调控基因purr被敲除或突变以使所述purr不具有调控作用或作用减弱。
16、在本专利技术的具体实施方案中，所述purr的核苷酸序列如seq id no:7所示；和/或，用于敲除所述purr的敲除质粒的骨架载体为ptargetf。
17、在本专利技术的具体实施方案中，所述基因工程菌株编码烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的基因nadd被敲除或突变以使烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶不表达或酶活降低，所述nadd的核苷酸序列优选如seq id no:8所示；和/或，所述基因工程菌株包含nad+跨膜转运蛋白基因ntt4，所述ntt4优选来源于衣原体protochlamydia amoebophila，更优选来源于衣原体protochlamydia amoebophila uwe25，进一步更优选所述ntt4的核苷酸序列如seq id no:9所示。
18、在本专利技术的具体实施方案中，所述包含nad+跨膜转运蛋白基因ntt4为向所述基因工程菌株的基因组中插入ntt4基因。
19、在本专利技术的具体实施方案中，在敲除所述nadd的同时，在nadd被敲除的位点引入ntt4；用于敲除所述nadd的敲除质粒的骨架载体优选ptargetf。
20、为解决上述技术问题，本专利技术提供的技本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为在保藏编号为CCTCCM2022922的出发菌株中过表达5'-核苷酸酶基因ushA。
2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述过表达5'-核苷酸酶基因ushA为向所述出发菌株中转入ushA表达质粒；优选地，所述ushA表达质粒的质粒骨架载体为pCDFDuet-1；
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株编码核糖核苷水解酶的基因rihA、rihB和rihC中的一个或多个被敲除或突变以使所述核糖核苷水解酶不表达或酶活降低；优选地：
4.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株编码6-磷酸果糖激酶I的基因pfkA被敲除或突变以使所述6-磷酸果糖激酶I不表达或酶活降低，所述pfkA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5所示；和/或，所述基因工程菌株过表达果糖-1,6-二磷酸酶I基因fbp，所述fbp的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6所示；
5.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的调控基因purR
6.如权利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株编码烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的基因nadD被敲除或突变以使烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶不表达或酶活降低，所述nadD的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8所示；和/或，所述基因工程菌株包含NAD+跨膜转运蛋白基因ntt4，所述ntt4优选来源于衣原体Protochlamydia amoebophila，更优选来源于衣原体Protochlamydia amoebophila UWE25，进一步更优选所述ntt4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
7.一种生产β-烟酰胺核糖的方法，其特征在于，所述方法包括：使用如权利要求1～6任一项所述的基因工程菌株，以烟酰胺为底物，发酵得到所述β-烟酰胺核糖；
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的步骤包括使用诱导剂进行诱导和对所述底物进行转化；所述诱导与所述转化同时进行，或先进行诱导后进行转化；
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵满足以下条件的一种或多种：
10.如权利要求1～6任一项所述的基因工程菌株在制备β-烟酰胺核糖中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为在保藏编号为cctccm2022922的出发菌株中过表达5'-核苷酸酶基因usha。
2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述过表达5'-核苷酸酶基因usha为向所述出发菌株中转入usha表达质粒；优选地，所述usha表达质粒的质粒骨架载体为pcdfduet-1；
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株编码核糖核苷水解酶的基因riha、rihb和rihc中的一个或多个被敲除或突变以使所述核糖核苷水解酶不表达或酶活降低；优选地：
4.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株编码6-磷酸果糖激酶i的基因pfka被敲除或突变以使所述6-磷酸果糖激酶i不表达或酶活降低，所述pfka的核苷酸序列优选如seq id no:5所示；和/或，所述基因工程菌株过表达果糖-1,6-二磷酸酶i基因fbp，所述fbp的核苷酸序列优选如seq id no:6所示；
5.如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的调控基因purr被敲除或突变以使所述purr不具有调控作用或作用...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴燕，郑孝富，王舒，田振华，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。