【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病理学，尤其涉及一种原位检测pd-l1在肿瘤组织中表达的病理学方法。
技术介绍
1、癌症是健康难题，但随着生命科学的迅猛发展，对pd-1/pd-l1信号通路的深入研究为攻克癌症提供了新的希望。该通路对免疫应答反应有重要调节作用，肿瘤利用其负调节作用发展。
2、目前，针对pd-1/pd-l1信号通路的单抗临床研究正在进行，其中nivolumab和pembrolizumab在晚期非小细胞型肺癌患者中取得了显著疗效。然而，只有约20％的患者受益，这种不均一性与患者是否表达pd-l1有关。因此，以pd-l1作为生物标志物筛选治疗患者是实现个体化免疫疗法的有效途径。
3、已经发现多种预测pd-1/pd-l1抑制剂疗效的标记物，如pd-l1表达水平、mmr表达状态和tmb等。其中，pd-l1的免疫组化检测研究得最早最充分。免疫组织化学检测是病理诊断中的常用手段，通过标记抗体与组织内抗原的特异性结合显色，对组织细胞内抗原进行定位、定性和定量研究。pd-l1检测是病理免疫组化中最复杂的检测，需要系统培训病理医师和技术人员，以确保pd-l1检测的质量控制。
4、目前，国内外研究关于pd-l1检测的方法几乎都集中在针对pd-l1的抗体上，抗体分为多克隆抗体与单克隆抗体。多克隆抗体特异性低，会产生抗体的交叉反应；单克隆抗体特异性强、抗体产量高。然而，单抗也具一些内在的缺陷，如价格昂贵、质量问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了
2、本专利技术是这样实现的，一种原位检测pd-l1在肿瘤组织中表达的病理学方法，包括以下步骤：序列合成及测序；pd-1-fc质粒构建：pd-1-fc融合蛋白的表达及鉴定：pd-l1的原位染色，利用pd-1-fc融合蛋白在收集的各种肿瘤的石蜡组织中进行原位染色。
3、作为本专利技术优选的，所述pd-1-fc质粒构建包括以下步骤：pd-1基因优化及合成；感受态细胞gh2的制备；pd-1-fc质粒构建。
4、作为本专利技术优选的，所述pd-1基因优化及合成的步骤包括：截取人pd-1基因序列中膜外段序列，其中包括起始密码子和信号肽，但是没有终止密码子；按照遗传密码子的简并性，对序列进行突变优化，使其满足cricetulus griseus(cho)细胞真核表达系统表达ap融合蛋白的要求，且其中不含常用的限制性内切酶位点，比如bamhi、saci、kpni、smai、psti、hindiii、bglii；在优化后的pd-1序列5’端连起始密码子atg之前插入kozak(5’-accccgcccgccacc-3’)序列，同时在pd-1序列5’端插入hindⅲ(5’-aagctt-3’)，3’端插入bglⅱ(5’-agatct-3’)的限制性内切酶位点，以便将pd-1序列插入fc-tag载体中。
5、作为本专利技术优选的，感受态细胞gh2的制备包括以下步骤：从-80℃取出大肠杆菌gh2在无抗性的lb固体培养基上划线，在可调恒温培养箱中37℃培养过夜，第二天挑取单菌落接种在装有5ml无抗性lb液体培养基的15ml离心管中，恒温振荡摇床37℃、220rpm震荡培养16h；取3ml菌液接种在100ml无抗性的lb液体培养基中，恒温振荡摇床37℃、220rpm震荡培养至菌液在550nm处的吸光值为0.5～0.6，冰上冷却10min后，4℃、4000rpm离心10min，弃上清；加入7.5ml预冷的0.1m的mgcl2溶液停滞菌液，重悬后4℃、4000rpm离心10min，弃上清；加入5ml预冷的0.1m cacl2溶液停滞菌液，重悬后冰浴20min，然后4℃、4000rpm离心10min，弃上清；加入17.2ml预冷的0.1m的cacl2溶液，冰浴30min后，加入5ml预冷的50％的甘油，吹打混匀后200μl/管分装至灭菌的0.5ml离心管中，立即投入液氮中，待其完全结冰后于-80℃保存。
6、作为本专利技术优选的，所述pd-1-fc融合蛋白表达包括以下步骤：cho宿主细胞传代培养；293t宿主细胞传代培养；质粒稳定转染至cho(dhfr-)细胞和瞬时转染至293t细胞；pd-1-fc高表达细胞株筛选；pd-1-fc高表达细胞株无血清驯化培养；pd-1-fc融合蛋白生产；pd-1-fc融合蛋白proteina亲和层析纯化；bca法测定pd-1-fc纯化蛋白浓度；sec-hplc检测pd-1-fc品纯度和测定分子量大小肿瘤组织原位染色。
7、作为本专利技术优选的，cho宿主细胞传代培养的步骤包括：cho宿主细胞采用imdm有血清培养基培养；进行cho(dhfr-)细胞复苏、传代培养和铺板。
8、作为本专利技术优选的，质粒稳定转染至cho(dhfr-)细胞和瞬时转染至293t细胞的步骤包括：观察所铺6孔中板细胞长势，吸走1ml旧的培养基；无血清imdm培养基37℃预热，fugene6转染试剂置于室温，用手指轻弹混匀；取一个1.5ml的灭菌离心管，向其中加入600μl无血清imdm培养基和18μlfugene6手指轻弹混匀后室温放置5min，然后平均分在6个1.5ml的灭菌离心管中，向其中3个离心管中各加入1μg待转染ppd-1-fc质粒，剩余3管种不加质粒作为对照组，手指轻弹混匀后，室温静置20min；将质粒混合液分别加入6孔板中，含ppd-1-fc或者不含质粒的混合液都是一管加入铺有cho(dhfr-)的六孔板中，一管加入铺有293t的六孔板中，按照上下左右十字晃动混匀后，将6孔板放回孵箱中培养72小时，72h后收集瞬转293t的培养基检测融合蛋白表达，以此判断培养基中否有目的蛋白分泌。
9、作为本专利技术优选的，所述pd-1-fc高表达细胞株无血清驯化培养的步骤包括：取加mtx压力到500nm条件下筛选出的pd-1-fc的高表达单克隆细胞在p100细胞培养皿中培养，待细胞生长密度达到80％～90％且状态良好时在p100培养皿中保留1ml原来的有血清imdm培养基，加入9ml无血清培养基sfm，将培养基中fbs的比例降至1％；37℃细胞孵箱培养24h，观察细胞悬浮情况和细胞状态，再次保留1ml原来的培养基，加入9mlsfm，此时培养基中fbs比例降至0.1％；37℃细胞孵箱培养24h，摇匀培养皿中细胞及培养基，取9ml至一无菌的15ml离心管中，从中取1ml进行vi-cell计数，并记录细胞数及细胞活性，剩余细胞调整细胞数转至0.25～0.5×106/ml，6ml/50ml离心管，置于37℃、5％co2孵箱摇床上180rpm/min悬浮培养；再重复上述操作。注意在无血清驯化培养过程中p100培养皿中始终保持500nm mtx压力，悬浮培养的细胞根据悬浮后细胞对mtx适应的实际情况将mtx降本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种原位检测PD-L1在肿瘤组织中表达的病理学方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种原位检测PD-L1在肿瘤组织中表达的病理学方法，其特征在于：
3.如权利要求1所述的一种原位检测PD-L1在肿瘤组织中表达的病理学方法，其特征在于：
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【技术特征摘要】
1.一种原位检测pd-l1在肿瘤组织中表达的病理学方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种原位检测pd-l1在肿瘤组织中表达的病理学方法，其特征在于：
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