【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体而言，本专利技术涉及针对基孔肯雅病毒的双特异性抗体及其用于制备药物的用途。
技术介绍
1、基孔肯雅热（chikungunya fever，chiκf）是一种最早在非洲发现的由基孔肯雅病毒（chikungunya virus，chiκv）引起的疾病，临床表现为发热、皮疹及躯体疼痛等，是继疟疾和登革热之后全球传播最快的蚊媒传染病之一。自1953年发现以来，chiκv从非洲传播到了世界100多个国家和地区，感染数百万人。2015年，世界卫生组织确定基孔肯雅病毒为可能导致严重疫情暴发的三种次危险病原体之一。目前，并没有针对基孔肯雅病毒的特异性治疗药物开发上市，因此研发预防用疫苗和特异性治疗药物对该病的防控至关重要。
2、目前，一些研究已经确定了多种多克隆或中和性单克隆抗体（monoclonalantibodies，mabs）对chiκv的感染具有保护作用。大多数已鉴定的针对chiκv的中和单克隆抗体靶向e2糖蛋白的表面暴露结构域。chiκv病毒e2蛋白有三个结构域，其中两个是中和抗体的主要靶点，包括b结构域和邻近的a结构域。此外，也已经在动物体内分离出了具有保护性的靶向e1蛋白的单克隆抗体，其功能是阻断病毒和宿主细胞膜融合，并与先天免疫细胞相互作用以促进病毒的清除。专利技术人前期通过流式分选-单细胞pcr技术从1名基孔肯雅热感染者恢复后15天的外周血的浆细胞中获得一种高中和活性抗基孔肯雅病毒的全人源单克隆抗体8d1，ic50值0.12 μg/ml (见cn 110903386 a)，但是其与chi
3、双特异性抗体（bispecific antibodies，bsab）的概念在1960年首次提出，是一种通过基因重组、化学偶联或四重杂交瘤的方式构建的、同时具有两个不同抗原结合位点的抗体，此类型抗体能同时特异性结合两种抗原或两个表位。相比于传统的单克隆抗体，bsab的灵敏度和特异性更高，具有募集免疫细胞、双重阻断信号通路等功能，近年来bsab类药物在肿瘤免疫治疗、抗感染、自身免疫性疾病等领域快速发展，从而实现“1+1>2”的治疗效果。
4、有效的重组双特异性抗体的形式对于最大化抗体治疗的效力至关重要。目前，已经开发了多种重组bsab形式，其中，在多特异性抗体设计中加入纳米抗体（vhh）结构的形式为药物研发的新方向，vhh可与各种形式抗体自由组合产生多种纳米双抗结构。vhh的结构相对简单，不存在vh和vl融合错误比例过高导致的生产难度大的问题，使得多抗药物的设计更加灵活，生产更加高效稳定，能够有效应对药物研发过程中的挑战。本专利技术的目的是提供一种结合igg和纳米抗体优势的新型bsab形式抗体，以补充和加强现有的chiκv抗体治疗方法。
技术实现思路
1、基于上述目的，本专利技术首先通过基孔肯雅病毒e2蛋白（本专利技术简称为chiκv e2蛋白或抗原）免疫骆驼，构建抗体文库，利用噬菌体展示技术筛选并提供了一种抗chiκv e2蛋白的驼源纳米抗体，所述驼源纳米抗体包括重链可变区，所述重链可变区cdr1、 cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-57、96-112位序列所示。
2、在一个优选的实施方案中，所述抗chiκv e2蛋白的纳米抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:1所示。在本专利技术中具有该具体技术方案的纳米抗体被命名为“10d5”。
3、其次，本专利技术提供了一种抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，所述双特异性抗体以抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体为亲本抗体，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体被命名为“8d1”（单克隆抗体8d1公开于cn 110903386 a，本专利技术通过引用将其公开内容纳入到本专利技术的说明书中）。在单克隆抗体8d1的重链或轻链的一端与上述的与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体10d5融合而成抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其中，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体8d1的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示。
4、在一个优选的实施方案中，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体8d1的重链恒定区的氨基酸序列和轻链恒定区的氨基酸序列分别如seq id no:7和seq id no:9所示。
5、在一个更为优选的实施方案中，所述融合以(ggggs)n连接肽连接的形式相融合，其中，n为1-4的自然数。本领域技术人员可以选用其它形式的连接肽也可以达到实施本专利技术的目的。
6、在本专利技术一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体以抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体8d1为亲本抗体，在其重链的n端与所述与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体10d5的c端相融合，即“vhh(h)-igg”形式，在本专利技术中所述双特异性抗体被命名为10d5-8d1-h；所述抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如seq id no:11和seqid no:13所示，或者，
7、在抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体8d1的轻链的n端与所述与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体的c端相融合，即“vhh(l)-igg”形式，在本专利技术中所述双特异性抗体被命名为10d5-8d1-k；所述抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如seqid no:15和seq id no:17所示，或者，
8、在抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体8d1的重链的c端与所述与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体的n端相融合，即“igg(h)-vhh”形式, 在本专利技术中所述双特异性抗体被命名为8d1-h -10d5；所述抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如seq id no:19和seq id no:13所示，或者，
9、在抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体8d1的轻链的c端与所述与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体的n端相融合，即“igg(l)-vhh”形式, 在本专利技术中所述双特异性抗体被命名为8d1- k -10d5；所述抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如seq id no:15和seq id no:21所示。
10、第三，本专利技术提供了一种多核苷酸，在一个优选的技术方案中，所述多核苷酸为编码上述的与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体10d5的多核苷酸，编码所述与chiκv e2蛋白结合的驼源纳米抗体10d5的多核苷酸的序列如seq id no:2所示。
11、在另一个优选的技术方案中，所述多核苷酸为编码上述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的多核苷酸，编码所述抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的重链和轻链的多核苷酸序列分别如seq id no:12和seq id no:14所示，在本专利技术中具有所述技术方案的双特异性抗体被命名为“10d5-8d1-h”本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种与基孔肯雅病毒E2蛋白结合的驼源纳米抗体，其特征在于，所述驼源纳米抗体的重链可变区的CDR1、 CDR2和 CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1第26-33、51-57、96-112位所示。
2. 根据权利要求1所述的与基孔肯雅病毒E2蛋白结合的驼源纳米抗体，其特征在于，所述驼源纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3. 一种抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体以抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体为亲本抗体，在其重链或轻链的一端与权利要求2所述的与基孔肯雅病毒E2蛋白结合的驼源纳米抗体融合而成，其中，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4. 根据权利要求3所述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列和轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQID NO:7和SEQ ID NO:9所示。
5.
6. 根据权利要求5所述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体以抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体为母本，在其重链的N端与所述基孔肯雅病毒E2蛋白结合的驼源纳米抗体的C端相融合，所述抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体的重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示，或者，
7. 一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求2所述的与基孔肯雅病毒E2蛋白结合的驼源纳米抗体，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
8. 一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求6所述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述多核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示，或者，
9.一种含有权利要求7或8所述多核苷酸的载体。
10.一种含有权利要求9所述载体的宿主细胞。
11.权利要求1或2所述的与基孔肯雅病毒E2蛋白结合的驼源纳米抗体在制备基孔肯雅病毒病预防或治疗药物中的应用。
12.权利要求3-6任一所述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体在制备基孔肯雅病毒病预防或治疗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1. 一种与基孔肯雅病毒e2蛋白结合的驼源纳米抗体，其特征在于，所述驼源纳米抗体的重链可变区的cdr1、 cdr2和 cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-57、96-112位所示。
2. 根据权利要求1所述的与基孔肯雅病毒e2蛋白结合的驼源纳米抗体，其特征在于，所述驼源纳米抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3. 一种抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体以抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体为亲本抗体，在其重链或轻链的一端与权利要求2所述的与基孔肯雅病毒e2蛋白结合的驼源纳米抗体融合而成，其中，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示。
4. 根据权利要求3所述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述抗基孔肯雅病毒的单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列和轻链恒定区的氨基酸序列分别如seqid no:7和seq id no:9所示。
5.根据权利要求4所述的抗基孔肯雅病毒的双特异性抗体，其特征在于，所述融合以(ggggs)n连接肽连...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，李建民，袁虹宇，宋丽媛，于长明，侯利华，迟象阳，杨益隆，房婷，董韵竹，范鹏飞，张冠英，付广成，强立，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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