【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，具体涉及一种组合物及文库构建方法。
技术介绍
1、转座酶法建库、机械法建库和片段化酶法建库是三种常见的dna文库构建方法。相较于后两种方法，转座酶法建库具有流程简化、效率高、低偏好及适用性广等突出优势。因此转座酶法建库一经问世便获得了极大的关注度，并快速在病原检测等各个领域得到广泛应用。
2、目前，转座酶建库的技术路线主要有以下两种。技术路线1：转座酶将双链dna片段化—片段化产物磁珠纯化(高投入量)或添加试剂终止片段化反应(低投入量)—产物扩增放大—磁珠纯化或分选获得文库。对于高投入量(例如25ng-100ng)的dna建库，片段化反应后产物需要经过磁珠纯化才能进行后续的扩增反应，获得高质量测序文库；而对于低投入量(例如10pg-10ng)的dna建库，片段化反应后仅需使用终止试剂进行室温孵育，即可进行后续扩增反应得到文库。此路线也是目前市面上大多数转座酶建库产品所采用的技术路线。技术路线2：转座酶片段化—片段化产物扩增放大—磁珠纯化或分选获得文库。此技术路线仅针对于小于1ng的低投入量建库，片段化反应后无需试剂终止，直接进行扩增反应即可获得文库。
3、虽然上述两种技术路线获得的高质量文库目前已可满足大部分需求，但随着转座酶建库应用范围的不断扩大，其潜在的建库风险或缺陷日益显现，其中包括：(1)不同的模板投入量建库流程不统一；(2)移液操作较多，限制了建库样本通量；(3)需要频繁开盖，增加了气溶胶污染和样本间交叉污染风险；(4)流程不统一且繁琐，无法完美适配自动化建库平台；(5)对于转座
4、因此，面对转座酶建库的风险和局限性，如何在常规建库方案中实现突破，提供一种既能够弥补常规转座酶法建库的缺陷，又同时能够满足市场新需求的建库方案，是转座酶建库技术更新迭代的关键。
技术实现思路
1、本申请旨在提供一种组合物，其能够适配不同投入量、不同类型和不同物种模板的高质量dna文库构建，真正实现不同投入量建库流程统一。进一步地，本申请还提供一种基于前述组合物的建库方法，其能够将转座酶建库的片段化反应体系和扩增反应体系合二为一，实现dna直投，上机一次即可获得高质量文库，极大程度提高了建库效率。
2、本申请的第一方面提供一种组合物，其包括：dna聚合酶、单链结合蛋白、dntp、金属盐、缓冲盐、季铵盐和pcr稳定剂，还包括聚乙二醇和二甲基甲酰胺中的一种或两种。
3、在一些实施方案中，所述dna聚合酶是本领域已知的任意dna聚合酶例如taq dna聚合酶、tth dna聚合酶、pfu dna聚合酶、vent dna聚合酶和kod dna聚合酶中的一种或多种。
4、在一些实施方案中，所述dna聚合酶包含一种、两种或多种dna聚合酶。
5、在一些实施方案中，所述dna聚合酶对不同长度片段的扩增具有低偏好性，例如通过dna聚合酶突变体或混合酶来实现。
6、在一些实施方案中，所述dna聚合酶对不同gc含量片段的扩增具有低偏好性，例如通过dna聚合酶突变体或混合酶来实现。
7、在一些实施方案中，所述单链结合蛋白是本领域一般技术人员已知的任意能够与dna单链区域结合的蛋白，例如t4噬菌体基因32编码蛋白(t4 gene 32protein，t4gp32)、超热稳定单链结合蛋白(et ssb)和reca蛋白。
8、在一些实施方案中，所述单链结合蛋白能够与单链dna结合，例如与扩增引物结合以避免扩增引物对片段化反应的抑制。在一些实施方案中，所述单链结合蛋白在温度大于50℃时与扩增引物分离，例如温度大于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃。
9、在一些实施方案中，所述聚乙二醇是分子量大于等于400的聚乙二醇例如peg400、peg600、peg4000、peg6000和peg8000和peg35000中的任意一种或多种，优选分子量大于等于4000的聚乙二醇例如peg4000、peg6000和peg8000和peg35000中的一种或多种，更优选分子量在4000-8000之间的聚乙二醇，最优选peg8000。
10、在一些实施方案中，所述peg8000的体积分数是1-30％，优选1-20％，包括所述范围内的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％。
11、在一些实施方案中，所述dntp的浓度是0.1-10mm，优选0.1-5mm，包括所述范围内的0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm和5mm。
12、在一些实施方案中，所述金属盐包含二价金属盐。
13、在一些实施方案中，所述二价金属盐是例如mg2+盐、co2+盐、mn2+盐和ca2+盐中的一种或多种，优选mg2+盐，优选mgcl2，更优选0.1-10mm mgcl2，包括所述范围内的0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm和10mm。
14、在一些实施方案中，所述金属盐还包含单价金属盐，所述单价金属盐是例如na+盐、k+盐、cs+盐和li+盐中的一种或多种。
15、在一些实施方案中，所述单价金属盐是na+盐，优选nacl，更优选10-300mm nacl，包括所述范围内的10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、120mm、150mm、170mm、190mm、200mm、220mm、250mm、270mm和300mm。
16、在一些实施方案中，所述金属盐包含mg2+盐，还包含前述单价金属盐和其他二价金属盐中的任意一种或多种。
17、在一些实施方案中，所述季铵盐是例如四甲基铵盐和四乙基铵盐中的一种或多种，又例如tmac、tmab、teac和tms中的一种或多种，优选tmac，更优选5-500mm tmac，包括所述范围内的5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、200mm、300mm、400mm和500mm。
18、在一些实施方案中，所述季铵盐用于提高扩增反应的特异性，例如通过改善引物的特异性结合以提高扩增反应的特异性，包括但不限于本领域一般技术人员已知的其他用途。
19、在一些实施方案中，所述二甲基甲酰胺的体积分数是1-30％本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组合物，其包括：DNA聚合酶、单链结合蛋白、dNTP、金属盐、缓冲盐、季铵盐和PCR稳定剂，还包括聚乙二醇和二甲基甲酰胺中的一种或两种。
2.权利要求1所述的组合物，所述聚乙二醇是分子量大于等于400的聚乙二醇，优选分子量大于等于4000的聚乙二醇，更优选PEG8000，最优选1-20％体积分数的PEG8000。
3.权利要求1所述的组合物，所述金属盐包含二价金属盐，所述二价金属盐是Mg2+盐、Co2+盐、Mn2+盐和Ca2+盐中的一种或多种，优选Mg2+盐，优选MgCl2，更优选0.1-10mM MgCl2。
4.权利要求1所述的组合物，所述DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Vent DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶中的一种或多种。
5.权利要求1所述的组合物，所述季铵盐是四甲基铵盐和四乙基铵盐中的一种或多种；优选地，所述季铵盐是TMAC、TMAB、TEAC和TMS中的一种或多种，优选TMAC，更优选5-500mMTMAC。
6.权利要求1所述的组合物，所述缓冲盐是
7.权利要求1所述的组合物，所述PCR稳定剂是牛血清蛋白、甘油、甜菜碱、甘油、海藻糖、表面活性剂、还原剂和二甲基亚砜中的一种或多种，优选牛血清蛋白和甘油，更优选10-500ng/μl的牛血清蛋白和5-40％体积分数的甘油。
8.权利要求7所述的组合物，所述表面活性剂是Tween20、Tween80、Triton X-100和NP-40中的一种或多种，优选TritonX-100，更优选0.01-10％体积分数的Triton X-100。
9.权利要求7所述的组合物，所述还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦酸酯(TCEP)、β-巯基乙醇中的一种或多种，优选DTT和TCEP，更优选0.01-5mM的DTT和0.01-5mM的TCEP。
10.权利要求1所述的组合物，所述二甲基甲酰胺的体积分数是1％-30％，优选1％-20％。
11.权利要求1所述的组合物，其还包含金属螯合剂，所述金属螯合剂是EDTA，优选0.01-5mM EDTA。
12.一种转座酶建库组合物，其包括权利要求1-11任一项所述的组合物、转座酶复合物和扩增引物。
13.权利要求12所述的转座酶建库组合物，所述转座酶复合物包含转座酶和转座子，所述转座子包含转座酶识别核心序列，优选OE序列或ME序列。
14.权利要求13所述的转座酶建库组合物，所述转座子还包括测序引物序列，所述测序引物序列是单链或双链，所述测序引物序列是一种或两种。
15.权利要求12所述的转座酶建库组合物，所述扩增引物包括与转座酶识别核心序列相同或互补的序列；优选地，所述扩增引物还包括索引序列(index)；优选地，所述扩增引物还包括与测序引物序列互补的序列。
16.权利要求12所述的转座酶建库组合物，所述扩增引物是带有接头序列的扩增引物，所述扩增引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物；优选地，所述第一接头序列是illumina平台的P5接头序列，所述第二接头序列是illumina平台的P7接头序列；更优选地，所述第一引物是N5引物，所述第二引物是N7引物。
17.一种转座酶建库反应体系，包括权利要求12-16任一项所述的转座酶建库组合物和DNA样本。
18.权利要求17所述的转座酶建库反应体系，所述DNA样本是双链DNA或双链DNA-RNA杂合体；优选地，所述DNA样本在反应体系中的终浓度是0.1pg/μl-10ng/μl。
19.一种建库方法，所述方法包括：配制权利要求17-18任一项所述的转座酶建库反应体系；在适宜的条件下进行打断反应、缺口补平反应和文库扩增反应。
20.权利要求19所述的方法，所述打断反应的条件是40-60℃反应5-20分钟，所述缺口补平反应的条件是70-75℃反应1-10分钟。
21.权利要求19所述的方法，所述文库扩增反应包括变性、退火和延伸，更优选包括预变性、变性、退火、延伸和完全延伸。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包括：权利要求1-11任一项所述的组合物或权利要求12-16任一项所述的转座酶建库组合物。
23.权利要求1-11任一项所述的组合物或权利要求12-16任一项所述的转座酶建库组合物和权利要求22所述的试剂盒在文库构建中的用途。...
【技术特征摘要】
1.一种组合物，其包括：dna聚合酶、单链结合蛋白、dntp、金属盐、缓冲盐、季铵盐和pcr稳定剂，还包括聚乙二醇和二甲基甲酰胺中的一种或两种。
2.权利要求1所述的组合物，所述聚乙二醇是分子量大于等于400的聚乙二醇，优选分子量大于等于4000的聚乙二醇，更优选peg8000，最优选1-20％体积分数的peg8000。
3.权利要求1所述的组合物，所述金属盐包含二价金属盐，所述二价金属盐是mg2+盐、co2+盐、mn2+盐和ca2+盐中的一种或多种，优选mg2+盐，优选mgcl2，更优选0.1-10mm mgcl2。
4.权利要求1所述的组合物，所述dna聚合酶是taq dna聚合酶、tth dna聚合酶、pfudna聚合酶、vent dna聚合酶和kod dna聚合酶中的一种或多种。
5.权利要求1所述的组合物，所述季铵盐是四甲基铵盐和四乙基铵盐中的一种或多种；优选地，所述季铵盐是tmac、tmab、teac和tms中的一种或多种，优选tmac，更优选5-500mmtmac。
6.权利要求1所述的组合物，所述缓冲盐是tris、hepes、mops、caps、taps中的一种或多种，优选tris，更优选10-500mm tris。
7.权利要求1所述的组合物，所述pcr稳定剂是牛血清蛋白、甘油、甜菜碱、甘油、海藻糖、表面活性剂、还原剂和二甲基亚砜中的一种或多种，优选牛血清蛋白和甘油，更优选10-500ng/μl的牛血清蛋白和5-40％体积分数的甘油。
8.权利要求7所述的组合物，所述表面活性剂是tween20、tween80、triton x-100和np-40中的一种或多种，优选tritonx-100，更优选0.01-10％体积分数的triton x-100。
9.权利要求7所述的组合物，所述还原剂是二硫苏糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦酸酯(tcep)、β-巯基乙醇中的一种或多种，优选dtt和tcep，更优选0.01-5mm的dtt和0.01-5mm的tcep。
10.权利要求1所述的组合物，所述二甲基甲酰胺的体积分数是1％-30％，优选1％-20％。
11.权利要求1所述的组合物，其还包含金属螯合剂，所述金属螯合剂是edta，优选0.01-5mm edta。
12.一种转座酶建库组合物，其包括权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉东，易文洋，曹林，聂俊伟，瞿志鹏，吴恒，舒涛，丁照云，安莹杰，朱涵雪，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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