【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，涉及一种表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒及其应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、卵巢癌组织学类型繁多，上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，eoc)占所有卵巢癌病理类型90％以上。高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer，hgsoc)是最具侵袭性和最常见的eoc类型，占所有死亡病例的75％。高致死率与卵巢癌患者早期临床症状不明显、复发率高以及对晚期和复发患者缺乏强有效的治疗方法有关。传统的手术联合放化疗，以及最新聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(poly(adp-ribose)polymerase inhibitors，parpis)和免疫检查点抑制剂的联合使用，使越来越多的卵巢癌患者从中获益，但总体5年生存率提高不大，迫切需要新的治疗方法。
3、近些年，针对肿瘤逃逸而采取的肿瘤免疫疗法，在对抗癌症中取得了令人鼓舞的治疗效果。卵巢癌是一种高度免疫原性肿瘤，生存率可因cd8+t细胞等肿瘤浸润淋巴细胞的存在得到很大的提高，由treg等抑制性细胞介导的免疫逃避机制与较差的存活率相关。现阶段，卵巢癌的免疫治疗方法有免疫检查点抑制剂、过继免疫治疗及治疗性肿瘤疫苗等。
4、过继免疫治疗(adoptive cell transfer therapy，act)是指采集人体自身免疫
5、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)是人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线可通过胞吐作用、细胞活化、释放细胞因子以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)杀伤肿瘤细胞，调节机体的免疫状态和免疫功能。car-nk细胞免疫疗法比car-t具有更好的安全性，car-nk细胞寿命短，避免了活化细胞在体内存在时间太长而杀伤正常组织；nk细胞不分泌il-1、il-6等炎症因子，因而crs发生风险低；此外，同种异体nk细胞输注耐受性良好，不会引gvhd和明显的毒性。car-nk具有广谱抗癌特性，nk细胞除通过单链抗体识别肿瘤表面抗原来抑制癌细胞外，还可通过多种受体识别各种配体来抑制癌细胞，例如自然细胞毒性受体(nkp46、nkp44和nkp30)、nkg2d和dnam-1(cd226)，且不受mhc限制；此外，nk细胞还可通过cd16介导的adcc机制清除肿瘤细胞。
6、腺病毒由34-39kb的线性基因组和一条双链dna组成。腺病毒基因分为早期基因(e1a，e1b，e2，e3，e4)和晚期基因(l1-l5)，早期基因是蛋白质合成和病毒基因组复制所必需的，晚期基因负责病毒逃离细胞和衣壳结构蛋白的合成。病毒通过肿瘤细胞与正常细胞之间遗传特征和表观遗传的差异来实现对肿瘤细胞的选择性感染和在肿瘤细胞内的选择性复制。此外，也可以在病毒基因组里插入肿瘤特异性的启动子，如人端粒酶逆转录酶(htert)启动子、癌胚抗原(cea)启动子、甲胎蛋白(afp)启动子等来实现病毒仅在肿瘤细胞内复制。病毒可通过直接溶瘤作用、诱导固有免疫应答杀伤肿瘤、诱导适应性免疫应答杀伤肿瘤、破坏肿瘤血供及改变肿瘤微环境等多种途径发挥抗肿瘤作用。
7、测试病毒疗法的首次临床试验表明靶向不足是治疗失败的主要原因之一。有证据表明，在许多eoc中，car和整合素的表达水平较低，且这些水平与肿瘤分级呈负相关。此外，影响病毒血管内递送时生物分布的相互作用已被广泛描述。
8、scfv(single chain variable fragment)是一种将抗体中可变结构域重链(vh)和轻链(vl)连接在一起的单链抗体(vh-vl)，具有分子量小、抗原性低和肿瘤浸润性强等优点，可通过组合来实现双特异性。
9、cd16是nk细胞表达的表面受体，可以激活nk细胞adcc作用。il-15具有广泛的免疫调节活性，可调节nk细胞等多种免疫细胞的活化增殖和趋化等，并增加其在体内的持久性，具有明显的抗肿瘤作用。
10、双特异性杀伤细胞接合器(bispecific killer cell engagers，bike)是由两个scfv或vhh组成的双特异性抗体，其中一个靶向免疫细胞表面受体cd16，另一个靶向肿瘤表面抗原，桥接nk细胞和肿瘤细胞，将nk细胞重定向到肿瘤细胞，促进nk细胞与肿瘤细胞间免疫突触的形成，激活nk细胞，杀伤肿瘤细胞。
11、三特异性杀伤细胞接合器(trispecific killer cell engagers，trike)是在bike的vhh和scfv之间串联一个il-15，发挥促进nk细胞的增殖和体内持久性、增加免疫细胞的抗肿瘤作用。在卵巢癌研究中，虽然靶向her2的单抗(曲妥珠单抗/帕妥珠单抗)宣告失败，但是由her2-scfv/il-15/cd16-vhh组成的trike，在临床前的研究中，体内外都表现出明显的抗肿瘤作用。这表明scfv、il-15及杀伤细胞协同累加的作用，能够取得超出单一治疗方式的疗效。然而，直接采用trike给药，存在持续全身给药引起的不良副作用。
12、muc16在大多数卵巢癌细胞高表达，仅在少部分正常组织(包括子宫、输卵管、卵巢和眼睛的角膜表面)低表达。muc16为i型跨膜蛋白，由释放结构域(ca-125)和保留结构域(muc-cd)组成。其中释放结构域释放到血液中，成为卵巢癌的血清标志物，保留结构域的胞外残端成为了卵巢癌治疗的理想靶点。
技术实现思路
1、为了增加trike的功效并减少持续全身给药引起的不良副作用，同时改善溶瘤腺病毒的靶向性，提升溶瘤腺病毒对实体瘤的杀伤效果，本专利技术提供了一种能够表达trike(尤其是表达muc16-trike)的重组溶瘤腺病毒，该重组后的病毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，表达的三特异性抗体包括抗MUC16单链抗体、NK细胞CD16的纳米抗体和IL-15，所述IL-15串联在MUC16单链抗体与NK细胞CD16的重链可变区之间。
2.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，抗MUC16单链抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或，抗MUC16单链抗体的VL的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
3.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，抗MUC16单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，IL-15的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，所述三特异性抗体同时靶向NK细胞CD16抗原和肿瘤抗原或肿瘤相关性抗原；优选地，所述肿瘤抗原或者肿瘤相关性抗原包括间皮素、叶酸受体α、MUC-16、EGFR、HER2、CD133、NKG2D、MUC1、WTI、NY-ES0-1、Su
6.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，基于5型腺病毒构建；
7.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，所述三特异性抗体的结构为：信号肽-VHH(CD16)
8.一种药物组合物，其特征是，包括权利要求1～7任一所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，以及药用辅料。
9.一种权利要求1～7任一所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒或权利要求8所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述肿瘤为卵巢癌；优选地，所述卵巢癌包括产生抗性的卵巢癌。
...【技术特征摘要】
1.一种表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，表达的三特异性抗体包括抗muc16单链抗体、nk细胞cd16的纳米抗体和il-15，所述il-15串联在muc16单链抗体与nk细胞cd16的重链可变区之间。
2.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，抗muc16单链抗体的vl的氨基酸序列如seq id no.1所示；或，抗muc16单链抗体的vl的核苷酸序列如seq idno.2所示；
3.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，抗muc16单链抗体的核苷酸序列如seq id no.5所示。
4.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，il-15的核苷酸序列如seq id no.6所示。
5.如权利要求1所述的表达三特异性抗体的溶瘤腺病毒，其特征是，所述三特异性抗体同时靶向nk细胞cd1...
【专利技术属性】
技术研发人员：苑存忠，盛辰晨，宋坤，李蓉蓉，闫实，孔北华，
申请(专利权)人：山东大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：
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