石斛色谱指纹图谱测定方法技术

本发明专利技术公开了一种石斛色谱指纹图谱测定方法，步骤如下：①将药用石斛剪断后，低温干燥，粉碎，过筛备用；②取适量样品于锥形瓶中，添加适量一元醇，超声２０ｍｉｎ，过滤，滤渣用一元醇淋洗多次，合并滤液，滤液挥至近干，③用一元醇溶解，定容，再用０．４５μｍ微孔滤膜过滤后作为供试品溶液；④分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行分析。本发明专利技术可以方便快捷的得到色谱图，而且原材料易得，工艺简单，技术先进。据文献记载，可以作为药用石斛的石斛属植物有近１００种。而且本发明专利技术通过多成分、多指标来控制产品的质量，相比上述质量控制指标，结果更加可靠，原材料易得，工艺简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种应用色谱指纹图谱技术，对药用石斛中提取的含酚类和黄酮类的化学成分制订色谱指纹图谱测定方法，以便于在原料采购、产品生产工艺流程中的各个步 骤的质量进行监控。
技术介绍
石斛是一类常用的贵重中药材，历代本草和各版药典均有收载，中外学者对多种 石斛的化学成分进行了研究和探索，发现该属植物所含的化学成分类型多样，包括多糖类、 生物碱、黄酮类、醌类、倍半萜类、香豆素类及甾体糖苷类化合物等成分。近年来，众多学者 对从多种石斛属植物中分离得到的成分进行了药理活性研究和临床应用。酚类化合物和黄 酮类化合物是石斛中的主要活性成分之一，如石斛中异黄酮类化合物异甘草苷，具有清除自由基、抗氧化的活性(罗丹等，2006)，因此，采用现代质控方法，制订石斛中酚类和黄酮 类化学成分质量控制标准是石斛生产厂家重点考虑的。而目前尚没有采用高效液相(HPLC) 指纹图谱技术对石斛酚类和黄酮类化合物进行质量控制的报道，因此，本方法对控制石斛 原料和产品的质量有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有质量控制技术的不足之处，且方法简单，可以方便快捷得到色谱图，并可利用该指纹图谱全面监控石斛的质量，以确保产品质量稳定的石斛色谱指纹图谱测定方法。 本专利技术的目的是这样实现的 ，步骤如下 ①、将药用石斛剪断后，低温干燥，粉碎，过筛备用； ②、取适量样品于锥形瓶中，添加适量一元醇，超声20min，过滤，滤渣用一元醇淋 洗多次，合并滤液，滤液挥至近干， ③、用一元醇溶解，定容，再用0. 45 ii m微孔滤膜过滤后作为供试品溶液； 、分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行分析； 上述步骤中检测条件为 色谱柱C18柱(ODS柱) 流速lml/min 检测波长254nm 柱温25。C 流动相乙腈(A)-l。；醋酸(B). 洗脱梯度5 % — 32 % A(O — 30min)，32 — 65 % A(30 — 55min)，65 — 32 % A (55 — 60min)。 如上所述的石斛色谱指纹图谱检测方法，其特征在于步骤①中过筛是过40-3003目筛。 如上所述的，其特征在所述的于一元醇为甲醇、乙醇、 异丙醇、正丙醇、正丁醇中的任意一种。 如上所述的，其特征在于所述的药用石斛为金钗石 角斗Dendrobium nobile Lindl.、环草石角斗D. loddigesii Rolfe.、黄草石角斗D. chrysanthum Wall.、马新更石斛D. fimbriatum Hook. Var. oculatumHook.、铁皮石斛D. candidum Wall, ex Lindl.中的任意一种。 本专利技术与石斛传统的质量控制方法相比，有如下突出优点 1、可以方便快捷的得到色谱图，而且原材料易得，工艺简单，技术先进。据文献记 载，可以作为药用石斛的石斛属植物有近100种。传统的质量控制方法，如外观性状鉴定、 显微鉴定、薄层鉴别、生物碱和总多糖含量测定等方法并不能满足上述近缘种鉴别的要求。 而上述药用石斛的药用价值并不相同，造成了市场上石斛药材质量的参差不齐、以次充好 的状况。 中药色谱指纹图谱技术通过多成分、多指标来控制产品的质量，相比上述质量控 制指标，结果更加可靠，原材料易得，工艺简单。 2、酚类和黄酮类为药用石斛的有效部位之一，因此本专利技术制订指纹图谱质量控制 方法，能有效表征药用石斛的质量。 3、本专利技术采用高效液相色谱法(HPLC)制订了药用石斛的指纹图谱，与采用气相 色谱法(GC)和分子生物学方法相比，本专利技术操作方法简单、分析速度快、成本低、重现性 好，特别适合大批量样品的分析。 4、利用本专利技术的测定方法，可得到石斛样品的指纹图谱色谱图。再借助计算机相 似度辅助评价软件，将样品图与共有模式图谱比较，通过相似度计算，即可评价原料品种、 产地、真伪优劣，以及判断产品质量的稳定性。附图说明图1是Spherisorb 0DS2C18色谱柱的指纹图谱； 图2. 1是PhenomenexC18 (250mm*4. 6mm*5 ii m， Luna)色谱柱的指纹图谱； 图2. 2是Spherisorb 0DS2C18色谱柱和Prodigy 0DS3色谱柱的指纹图谱； 图2. 3是Prodigy 0DS3色谱柱、Zorbax SBC18色谱柱和PhenomenexC18色谱柱的 指纹图谱； 图3是空白实验色谱图； 图4是供试品溶液稳定性的色谱图； 图5是供试品溶液重性色谱图； 图6是供试品溶液精密度色谱图； 图7是金钗石斛酚类、黄酮类指纹图谱； 图8是20批金钗石斛酚类和黄酮类成分指纹图谱的共有模式； 图9是图8中编号20的指纹图谱； 图10是图8中编号4的指纹图谱； 图11是图8中编号5的指纹图谱； 图12是背景扣除后得到24. 848min色谱峰的光谱图； 图13是背景扣除后得到25. 281min色谱峰的光谱图。具体实施方式从实验目标出发，在实验中我们选择并比较了不同的C18(0DS柱)色 谱 柱Spheris-orb 0DS2 (150mm*4. 6mm*5 u m， waters) 色 谱 柱、Phenomenex C18 (250mm*4. 6mm*5 u m， Luna)色谱柱、Zorbax SBC18 (250mm*4. 6mm*5 u m， Aglient)色谱柱、 Spherisorb 0DS2 (250mm氺4. 6mm氺5 u m， waters)色i普柱、Prodigy 0DS3 (250mm氺4. 6mm氺5 u m， Phenomenex)色谱柱对金钗石斛酚类和黄酮类成分的色谱组分的分离效果的影响。如 图1所示Spherisorb 0DS2 (150mm氺4. 6mm氺5 u m， waters)色i普柱，Spherisorb 0DS2柱 出峰数量、峰高、峰型均较好而出峰密集、分离度远远达不到实验要求，因此实验最终没有采用150mm*4. 6mn^5iim类型的色谱柱。实验过程中采用的250mm*4. 6mm*5 y m类型 色谱柱分离效果好，出峰时间合适，符合色谱分离最优化原则，故而采用此类型色谱柱进 行实验。通过不同250mm*4. 6mn^5iim类型色谱柱所得色谱图比较(图2. 1、2.2、2.3)， 最终确定分离效果最好的Prodigy 0DS3 (250mm*4. 6mm*5 y m， Phenomenex)色谱柱进行 待测样本分析(Spherisorb 0DS2 (250mm*4. 6mm*5 ii m， waters)色谱柱柱效降低严重拖 尾)。图2. 3中，1为Prodigy 0DS3 (250mm氺4. 6mm氺5 u m， Phenomenex)色i普柱2为Zorbax SBC18 (250mm*4. 6mm*5 u m， Aglient)色谱柱；3为PhenomenexC18(250mm*4. 6mm*5 u m， Luna) 色谱柱。 —个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯 品和低毒性等特征。基于此几项要求，并在实验所得金钗石斛酚类和黄酮类成分分离效果 最好的前提条件下，选择了乙腈-1%。乙酸系统作为流动相。通本文档来自技高网...

【技术保护点】
石斛色谱指纹图谱测定方法，步骤如下：①、将药用石斛剪断后，低温干燥，粉碎，过筛备用；②、取适量样品于锥形瓶中，添加适量一元醇，超声２０ｍｉｎ，过滤，滤渣用一元醇淋洗多次，合并滤液，滤液挥至近干，③、用一元醇溶解，定容，再用０．４５μｍ微孔滤膜过滤后作为供试品溶液；④、分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行分析。上述步骤中检测条件为：色谱柱：Ｃ↓［１８］柱（ＯＤＳ柱）流速：１ｍｌ／ｍｉｎ检测波长：２５４ｎｍ柱温：２５℃流动相：乙腈（Ａ）－１‰醋酸（Ｂ）．洗脱梯度：５％→３２％Ａ（０→３０ｍｉｎ），３２→６５％Ａ（３０→５５ｍｉｎ），６５→３２％Ａ（５５→６０ｍｉｎ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：成金乐，李先霞，徐吉银，梁逸曾，易伦朝，
申请(专利权)人：中山市中智药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]