【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种基于crispr-cas9敲除鸡ephrina2基因的细胞系的构建方法。
技术介绍
1、crispr-cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统，用于对抗病毒的入侵和外源dna。其中ⅱ型crispr-cas系统运用最为广泛，主要由rna导向的cas9核酸内切酶、一条导向rna(sgrna)和反式激活rna(tracrrna)组成。在这一系统中，crrna(crispr-derived rna)通过碱基配对与tracrrna结合形成双链rna，引导cas9蛋白到靶序列上，在pam序列上游3bp位置特异性剪切dna双链，造成dna双链断裂(dsb，double strand break)，从而启动细胞内的dna损伤修复机制，导致修复后发生碱基缺失或插入，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的。
2、eph受体是受体酪氨酸激酶(rtk)中最大的亚家族。eph与其配体ephrin构成了一个功能多样的细胞信号网络，两者间的互作调控着信号通路的双向激活。据报道，eph受体及其ephrin配体与病毒感染、细胞黏附以及血管生成有关，且已被证明会影响癌细胞的生长、转移和入侵。epha2是受体酪氨酸激酶eph家族中的一员，ephrina2是其重要的结合配体之一。然而，ephrina2在禽类相关疾病中的作用研究未见报道。
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于crispr-cas9敲除鸡ephrina2基因的细胞系
2、本专利技术构建的鸡源ephrina2敲除的细胞系较野生型细胞的增殖效率显著下降。
3、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种基于crispr-cas9敲除鸡ephrina2基因的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)构建特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna，所述sgrna位于鸡ephrina2基因的第一个外显子区域，其靶序列唯一；
5、(2)构建含有cas9蛋白基因和上述特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna的敲除质粒；(3)将步骤(2)构建的敲除质粒对细胞进行转染，利用crispr-cas9系统达到基因沉默，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源ephrina2敲除的细胞系。
6、其中，步骤(1)中所述sgrna的靶位点位于ephrina2基因的第一个外显子，该外显子序列如seq id no.1所示。
7、其中，步骤(1)中所述的特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna的模板链及其互补链，其序列如seq id no.2-3所示。
8、其中，步骤(1)中靶向鸡ephrina2基因的sgrna制备方法，包括将合成的sgrna编码链和互补链退火形成双链dna，之后通过bsmbi限制性内切酶酶切载体，将双链dna置于t7启动子之下构建获得。
9、其中，步骤(2)中所述的敲除质粒中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和靶向鸡源ephrina2基因的sgrna编码链和互补链。
10、其中，步骤(2)中所述敲除质粒中cas9蛋白编码基因和sgrna序列位于同一载体上，所述载体优选为lenticrispr v2。
11、其中，步骤(3)中构建的含有cas9蛋白基因和上述特异性靶向鸡源ephrina2基因的sgrna的敲除质粒利用转染试剂对df-1细胞进行转染，通过crispr/cas9基因编辑系统实现对df-1细胞中ephrina2基因的沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，通过细胞亚克隆获得ephrina2基因敲除的单克隆df-1细胞株，经鉴定后，扩大培养，最终获得鸡源ephrina2敲除的df-1细胞系。
12、本专利技术所述的构建方法所构建的敲除鸡ephrina2基因的细胞系。
13、其中，所述敲除鸡ephrina2基因的细胞为增殖效率显著下降的鸡细胞。
14、本专利技术所述的构建方法所构建的敲除鸡ephrina2基因的细胞系在解析鸡体内ephrina2功能及其禽肿瘤性病毒感染致病中的应用。
15、鸡ephrina2基因在鸡细胞中调控细胞增殖中的应用，敲除鸡ephrina2基因的细胞增殖效率显著下降。
16、本专利技术首先提供了一种特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna，所述的sgrna均位于鸡ephrina2基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一，所述sgrna如下表1所示。本专利技术所述sgrna针对鸡ephrina2基因的靶位点，其序列如seq id no.1所示。
17、本专利技术提供了一种用于靶向敲除鸡ephrina2基因的crispr-cas9系统，在所述的系统中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和编码sgrna的编码序列。其次，本专利技术所述的crispr-cas9系统中，cas9蛋白的编码序列与sgrna的编码序列位于同一质粒上，所述的质粒为lenticrispr v2。
18、敲除的具体操作如下：
19、(1)利用ncbi在线数据库查找鸡ephrina2基因组序列
20、ncbi reference sequence:nm_204983.1
21、选定该基因的第一个外显子设计敲除靶位点，第一个外显子的序列如seq idno.1所示。
22、(2)sgrna的构建：设计好的sgrna编码链和互补链分别命名为sgrna_f和sgrna_r，把引物稀释至100μm浓度，体系如下：sgrna_f和sgrna_r各1μl，pcr buffer 1μl，ddh2o 7μl，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链dna。另一方面，利用bsmbi限制性内切酶酶切lenticrispr v2载体，酶切体系如下：bsmbi限制性内切酶1μl，lenticrispr v2质粒1μg，0.1m dtt 0.5μl，neb buffer3.1 5μl，其余用ddh2o补至50μl，酶切条件为55℃15min，之后通过跑胶后胶回收获得含有粘性末端的lenticrispr v2载体质粒。最后，将获得的sgrna与酶切后的载体质粒通过连接酶连接，最终将sgrna插入lenticrispr v2质粒中，获得sgrna和cas9蛋白基因位于同一载体的质粒，命名为ephrina2-sgrna。
23、(3)敲除细胞系的获得：6孔板中转染构建好的ephrina2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas9敲除鸡EphrinA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述sgRNA的靶位点位于EphrinA2基因的第一个外显子，该外显子序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的特异性靶向鸡EphrinA2基因的sgRNA的模板链及其互补链，其序列优选如SEQ ID NO.2-3所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中靶向鸡EphrinA2基因的sgRNA制备方法，包括将合成的sgRNA编码链和互补链退火形成双链DNA，之后通过BsmBI限制性内切酶酶切载体，将双链DNA置于T7启动子之下构建获得。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的敲除质粒中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡EphrinA2基因的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和靶向鸡源EphrinA2基因的sgRNA编码链和互补链；步骤(2)中所述敲
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中构建的含有Cas9蛋白基因和上述特异性靶向鸡源EphrinA2基因的sgRNA的敲除质粒利用转染试剂对DF-1细胞进行转染，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统实现对DF-1细胞中EphrinA2基因的沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，通过细胞亚克隆获得EphrinA2基因敲除的单克隆DF-1细胞株，经鉴定后，扩大培养，最终获得鸡源EphrinA2敲除的DF-1细胞系。
7.一种权利要求1所述的构建方法所构建的敲除鸡EphrinA2基因的细胞系。
8.根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于，所述敲除鸡EphrinA2基因的细胞为增殖效率显著下降的鸡细胞。
9.一种权利要求1所述的构建方法所构建的敲除鸡EphrinA2基因的细胞系在解析鸡体内EphrinA2功能及其禽肿瘤性病毒感染致病中的应用。
10.鸡EphrinA2基因在鸡细胞中调控细胞增殖中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas9敲除鸡ephrina2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述sgrna的靶位点位于ephrina2基因的第一个外显子，该外显子序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna的模板链及其互补链，其序列优选如seq id no.2-3所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中靶向鸡ephrina2基因的sgrna制备方法，包括将合成的sgrna编码链和互补链退火形成双链dna，之后通过bsmbi限制性内切酶酶切载体，将双链dna置于t7启动子之下构建获得。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的敲除质粒中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡ephrina2基因的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和靶向鸡源ephrina2基因的sgrna编码链和互补链；步骤(2)中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李拓凡，王泽铭，相汝苹，武佳妍，王胜男，谢泉，万志敏，邵红霞，秦爱建，叶建强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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