【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其包含在哺乳动物谷氨酰胺合成酶中的氨基酸位置10和/或298处的突变，其中所述突变选自r298k、n10s、n10t和n10q，并且涉及编码所述修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的表达载体、核酸和真核宿主细胞，以及其作为选择标记物的用途。本专利技术进一步涉及用于制备稳定细胞系的方法，或使用所述修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶用于选择以用于生产感兴趣的蛋白质的方法。
技术介绍
1、中国仓鼠卵巢(cho)细胞是用于生产治疗性蛋白质例如抗体的最常用哺乳动物细胞系之一。一个重要的方面是生成高产且稳定的细胞系，其在短时间段内且以高产物滴度伴随合适的产物质量表达感兴趣的蛋白质。为了产生稳定且高产的细胞系，需要选择阶段以生成由不同克隆组成的稳定的异质细胞池，在最终生产细胞系可以保存于细胞库中之前，所述异质细胞池需要进行分离且筛选。代谢选择系统例如二氢叶酸还原酶(dhfr)和谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统通常用于改善这个过程，并且更有效地生成稳定细胞系。
2、在缺乏dhfr基因的细胞系例如cho-dg44细胞中，在培养基中不存在次黄嘌呤和胸苷的情况下进行选择。另外，可以使用通过添加增加浓度的氨甲蝶呤(mtx)的扩增步骤。gs选择系统是有利的，因为它需要更少的基因拷贝用于存活，并且因此关于高产细胞池的选择更快。
3、谷氨酰胺合成酶(ec 6.3.1.2，也称为γ-谷氨酰:氨连接酶)催化atp依赖性的氨和谷氨酸盐的缩合，以形成谷氨酰胺。谷氨酰胺合成酶分类为三个亚组：gsi、gsii和gsii
4、gs是一种普遍存在的对于氮代谢必需的酶。因此，gs已用作经由哺乳动物表达构建体引入的选择标记物。在并未表达足够水平的内源性gs的细胞系中，从细胞培养基中去除谷氨酰胺补充增加对细胞的选择压力。在内源性gs水平不足的细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系中，在不存在谷氨酰胺或缺乏谷氨酰胺补充的情况下的培养提供了足够的选择压力，以分离稳定的重组细胞系。在内源性gs充足的细胞系例如cho细胞中，需要gs抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(msx)的添加或gs敲除细胞(gs-/-或gs-/+)的生成，以允许在不存在谷氨酰胺的情况下足够的选择压力，以分离生产性细胞系。cho gs敲除细胞中的选择严格性得到极大改善，并且已进一步报道了，在弱启动子的控制下转染的gs基因的表达改善选择严格性，伴随或不伴随msx的使用。除选择严格性和生产率之外，高产克隆的蛋白质生产的稳定性已显示为关键属性。
5、另外，转染的谷氨酰胺合成酶选择标记物对选择过程和基于cho的细胞系的表型稳定性以及生产率具有重大影响。例如，cho谷氨酰胺合成酶的减弱变体的使用进一步显示了改善稳定性、选择行为和生产率(lin等人(2019)，mabs，11:5，965-976；wo2018093331、us20190352631、wo2017197098)。大多数描述的减弱变体具有在保守的底物结合残基中的突变。例如，在患有先天性gs缺乏症的两个无关婴儿中首次鉴定了含有r324c和r341c突变的两种减弱的gs突变体(lin等人(2019)，mabs，11:5，965-976)。据报道涉及谷氨酸盐结合的残基是e134、e136、e196、e203、n248、g249、h253、r299、r319、e338和r340；据报道涉及atp结合的残基是w130、a191、g192、p208、n255、s257、r262、r324和y336；并且涉及氨结合的残基是d63、s66、d162和e305(氨基酸编号参考人gs)(krajewski等人(2008)，j.mol.biol.375，217-228和wo 2018/093331)。分别的坐标和结构因子数据可经由pdb登录码2uu7、2ojw和2qc8获得。进一步地，在cn114085819a中，cho谷氨酰胺合成酶的预测复合物结构中距离msx或adp/atp内的残基据报道在人、犬和cho野生型谷氨酰胺合成酶中是相同的，即v197、q201、q205、a250、g251、h304、t306和r324，其中仅单一突变体r324c且特别是三重突变体v197w、a250f和r324k(gsm1)据报道提供了减弱gs和稳定克隆。
6、尽管具有活性位点中的突变的减弱gs变体显示了增加的选择严格性、但选择过程的持续时间和总体细胞生长特性可能是受损的，负面影响生物过程性能，使得这些突变体经常并不适合于治疗性抗体的制造。选择标记物的减弱是在选择严格性、整合的拷贝数和合适的细胞培养性能(例如生长行为)之间的微妙平衡，以支持重组蛋白质的制造。因此，需要开发新型减弱的gs变体以改善细胞系开发中的哺乳动物表达载体，并且生成具有精细平衡的选择严格性的选择标记物变体实验对象组，特别是在不存在gs抑制剂例如msx的情况下。
技术实现思路
1、本专利技术证实了，具有单一点突变的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的三种变体导致生成高产且稳定的宿主细胞池，其表达治疗性蛋白质，特别是治疗性抗体，由于与野生型谷氨酰胺合成酶相比减弱的活性、以及在cho细胞中有益的细胞培养性能，显示了更严格的选择行为。所有三种突变都赋予了增加的选择严格性，并且出乎意料地导致当与野生型gs比较时，具有更高生产率和/或稳定性的稳定宿主细胞池，使得这些变体在细胞系开发中更佳。突变的氨基酸位置尚未进行描述，并且与酶的催化结合口袋并非直接相关，而是似乎通过驱动结构相互作用来影响蛋白质的稳定性。这些蛋白质变体是特别有利的，因为它们携带在底物结合位点外部，例如在蛋白质界面处的突变，其对于多聚体gs蛋白质复合物的组装是重要的-给出了以更温和的方式调节减弱的另外手段。
2、更具体而言，本专利技术涉及修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其包含在哺乳动物谷氨酰胺合成酶中的氨基酸位置10和/或298处的突变，所述哺乳动物谷氨酰胺合成酶具有seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列或者与seq id no:1、2、3或4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述突变选自r298k、n10s、n10t和n10q。特别地，突变并不干扰底物结合。
3、在某些实施方案中，包含选自r298k、n10s、n10t和n10q的突变的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶：(a)与不含突变的相同哺乳动物谷氨酰胺合成酶相比，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其包含在哺乳动物谷氨酰胺合成酶中的氨基酸位置10和/或298处的突变，所述哺乳动物谷氨酰胺合成酶具有SEQ ID NO:1、2、3或4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1、2、3或4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述突变选自R298K、N10S、N10T和N10Q。
2.权利要求2的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其中所述突变并不干扰底物结合。
3.权利要求1或2的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其中包含选自R298K、N10S、N10T和N10Q的突变的所述修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶：(a)与不含突变的相同哺乳动物谷氨酰胺合成酶相比，具有减少的酶促活性；和/或(b)与不含突变的相同哺乳动物谷氨酰胺合成酶相比，在用编码修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的多核苷酸和转基因转染后，介导增加的选择严格性和/或遗传稳定性。
4.一种表达载体，其包含编码权利要求1至3中任一项的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的多核苷酸。
5.根据权利要求4的表达载体，其中所述表达载体进一步包含编码感兴趣的蛋白质和/或
6.一种核酸序列，其包含可操作地连接到真核启动子的编码权利要求1至3中任一项的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，任选地进一步包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码RNA的至少一种多核苷酸。
7.一种真核宿主细胞，其包含编码权利要求1至3中任一项的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的多核苷酸序列、权利要求4或5的所述表达载体或者权利要求6的所述核酸序列。
8.一种用于制备稳定表达感兴趣的蛋白质和/或非编码RNA的细胞的方法，其包括
9.一种生产感兴趣的蛋白质的方法，其包括
10.权利要求8或9的方法，其中所述表达载体通过转染或转导引入。
11.一种生产感兴趣的蛋白质的方法，其包括
12.权利要求7的真核宿主细胞或权利要求8至11中任一项的方法，其中所述真核宿主细胞是(a)哺乳动物宿主细胞，优选啮齿类动物细胞，更优选CHO细胞；和/或(b)GS敲除突变体。
13.一种试剂盒，其包含权利要求4或5的表达载体和不含谷氨酰胺的细胞培养基。
14.根据权利要求1至3的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶作为用于单克隆真核细胞系生成，优选哺乳动物细胞系生成，更啮齿类动物细胞系生成，甚至更优选CHO细胞系生成的选择标记物的用途。
15.根据权利要求4或5中任一项的载体用于在真核宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞，更优选啮齿类动物细胞，甚至更优选CHO细胞中生产感兴趣的蛋白质的用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其包含在哺乳动物谷氨酰胺合成酶中的氨基酸位置10和/或298处的突变，所述哺乳动物谷氨酰胺合成酶具有seq id no:1、2、3或4的氨基酸序列或者与seq id no:1、2、3或4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中所述突变选自r298k、n10s、n10t和n10q。
2.权利要求2的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其中所述突变并不干扰底物结合。
3.权利要求1或2的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶，其中包含选自r298k、n10s、n10t和n10q的突变的所述修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶：(a)与不含突变的相同哺乳动物谷氨酰胺合成酶相比，具有减少的酶促活性；和/或(b)与不含突变的相同哺乳动物谷氨酰胺合成酶相比，在用编码修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的多核苷酸和转基因转染后，介导增加的选择严格性和/或遗传稳定性。
4.一种表达载体，其包含编码权利要求1至3中任一项的修饰的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的多核苷酸。
5.根据权利要求4的表达载体，其中所述表达载体进一步包含编码感兴趣的蛋白质和/或非编码rna的至少一种多核苷酸，优选地其中所述感兴趣的蛋白质是选自细胞因子、激素、融合蛋白、抗体、抗体衍生分子和抗体模拟物的治疗性蛋白质。
6.一种核酸序列，其包含可操作地连接到真核启动子的编码权利要求1至...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·施密特，S·菲舍尔，A·默尔，P·舒尔茨，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。