【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种卫星病毒dna1在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法。
技术介绍
1、双生病毒被认为是一类具有严重危害性的植物病原体，引起世界范围内粮食、饲料和纤维作物的重要经济病害，对全球众多关键的经济作物种植产业造成了极大的破坏。目前，双生病毒成为最大的病毒家族，也是最多样化的病毒家族之一。该科病毒已在亚洲、欧洲、美洲和非洲等多个国家和地区的粮食作物与经济作物上引起了极大的危害，带来巨大的经济损失。
2、双生病毒具有广泛宿主范围，它能够侵染多种植物，对这些植物造成不同程度的病害，包括玉米、番茄、棉花和木薯等多种重要的农作物。依据最新的报告结果，双生病毒科病毒根据宿主范围、昆虫传播方式和基因组结构的特征被划分为14个不同的属，其中菜豆金色花叶病毒属和甜菜曲顶病毒属的成员常引起经济上的重要疾病。
3、菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)是双生病毒科中最大的属，包括多种重要的病毒，如番茄黄化曲叶病毒、烟草曲茎病毒、番茄金色花叶病毒等。番茄黄化曲叶病毒(tylcv)具有极强的传播能力，能够迅速入侵新的地区，对全球番茄生产造成了极大的影响，具有巨大的经济重要性。tylcv感染后的典型症状包括植株生长不良、叶片卷曲、褪绿、叶片大小减少，最终导致番茄产量减少。这些症状严重影响了番茄的产量和质量，给全球番茄产业带来了巨大的经济损失。
4、甜菜曲顶病毒属(curtovirus)都是单组份病毒，它们能感染多种蔬菜作物，导致植株生长发育迟缓、叶片卷曲和根结构发育异常等严重症
5、dna1是伴随双生病毒的一种dna小分子，它被认为是由nanovirus进化而来，通过长度的增加从而被双生病毒cp包裹。dna1编码复制相关蛋白rep，rep含有滚环复制的保守结构域，叶盘复制试验表明dna1分子能自我复制而且辅助病毒dna能增加dna1的复制，说明两者之间有直接的相互作用。研究表明，dna1与同源辅助病毒或begomovirus
6、/dnaβ复合物共同接种后不仅能够减弱病毒的症状而且对病毒dna的积累有抑制作用。
7、现阶段尚没有有效的化学药剂对该科病毒进行防治，防治上通常以防虫控病和农业防治为主，但这样的防治方式有一定的困难且效率不高，对病毒病防控最重要的还是利用抗性基因或者选育抗病品种。然而，由于目前可用的抗双生病毒抗性品种不具有广谱性，抗性极易丢失，因此鉴定新的抗性机制、培育新的抗性资源具有重要意义。本研究通过转化能够抑制双生病毒侵染的dna1，获得的转基因植物dna1。由于转基因植物种含有的dna1能够竞争并抑制双生病毒dna的复制，因此可以作为“疫苗”有效防控双生病毒侵染。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的是提供一种卫星病毒dna1在调控植物抗病毒中的应用。
2、本专利技术的第二目的是提供一种卫星病毒dna1转入植物从而获得高表达稳定遗传材料的转基因植物培育方法。
3、本专利技术研究团队经过大量实验确认了一种抗病dna分子，通过农杆菌转化的方法将其导入本氏烟中，获得了稳定遗传的高表达材料，可以实现对bsctv和tylcv侵染的有效抑制，在一定程度上控制bsctv和tylcv的危害。
4、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
5、卫星病毒dna1在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述卫星病毒dna1序列如seqid no:1所示，所述病毒为双生病毒科病毒。
6、其中，所述双生病毒科病毒包括番茄黄化曲叶病毒和甜菜严重曲顶病毒。
7、通过农杆菌感染叶片外植体并短期共培养的方式，将dna1导入目的植物中，获得的本氏烟dna1高表达植物能够显著减轻双生病毒科病毒的侵染，抑制双生病毒科病毒侵染所造成的病害。
8、包括以下步骤：
9、(1)感染烟草曲茎病毒及卫星病毒dna1的本氏烟草进行叶片取样，ctab法提取总dna为模板，以dna1-f1(引入xba1位点)和dna1-r1(病毒序列内含有ecor1)为引物进行pcr扩增，得到全长dna1；所述引物dna1-f1与dna1-r1如seq id no:2和seq id no:3所示；
10、dna1-f1：gagaacacgggggactctagcagggtactgtagctgaaatt；
11、dna1-r1：gaattccagggtactgtagctgaaa；
12、(2)将全长dna1克隆到pmd-18t载体，获得克隆pmd-18t-卫星病毒dna1-xe。将该克隆经xba1和ecor1酶切后插入植物表达载体pcambia2300上，得到克隆pcambia2300-卫星病毒dna1-xe；
13、(3)以总dna为模板，进行rca扩增，扩增后用ecor i进行酶切，切出一个含有ecori粘性末端的dna1；
14、(4)将第二个含有ecor i粘性末端的全长dna1克隆由ecor1酶切后的pcambia2300-卫星病毒dna1-xe载体上，从而获得含有2个dna1的侵染性克隆pcambia2300-2-卫星病毒dna1；
15、(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染预培养的本氏烟外植体，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得t0代小苗，转移继续培养；
16、(6)待小苗生长稳定后，取叶片样品，使用ctab法抽提dna；以提取的dna为模板，利用引物dna1-f与dna1-r进行pcr扩增，确定植物中转入了外源dna1序列；所述引物dna1-f与dna1-r如seq id no:4-5所示；
17、dna1-f：atcagcagatcctccacgtgtat；
18、dna1-r：ggcaagaggaagagtctc。
19、(7)对t0代阳性转基因材料进行相关表达水平的检测，使用引物dna1-qfor和dna1-qrev对株系总rna进行qrt-pcr检测过表达水平；所述引物dna1-qfor和dna1-qrev的序列如seq id no:6-7所示；
20、dna1-qfor：cctcgttcccgtgtttgaga；
21、dna1-qrev：tcgcaagcttcgtctgtctt。
22、(8)对本氏烟过表达dna1的转基因稳定遗传植物进行全生育期观察并留种，获得t1代阳性种子进行实验。
23、同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
24、本专利技术通过农杆菌感染叶片外植体并短期共培养的方式将卫星病毒dna1分子转入植物后，获得了本氏烟dna1高表达转基因植物。获得的卫星病毒dna1转基因植物能够显著减轻双生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.卫星病毒DNA1在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述卫星病毒DNA1序列如SEQ ID NO:1所示，所述病毒为双生病毒科病毒。
2.根据权利要求1所述的卫星病毒DNA1在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述双生病毒科病毒包括番茄黄化曲叶病毒和甜菜严重曲顶病毒。
3.根据权利要求2所述的卫星病毒DNA1在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌感染叶片外植体并短期共培养的方式，将DNA1导入目的植物中，获得的本氏烟DNA1高表达植物能够显著减轻双生病毒科病毒的侵染，抑制双生病毒科病毒侵染所造成的病害。
4.一种抗双生病毒毒科病毒的DNA1转基因植物培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法将卫星病毒DNA1导入目的植物中，获得本氏烟DNA1高表达植物，所述DNA1序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述的DNA1转基因植物培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的DNA1转基因植物培育方法，其特征在于：所述引物DNA1-F1和DNA1-R1如SEQ ID NO：2
7.根据权利要求5所述的DNA1转基因植物培育方法，其特征在于：所述引物DNA1-F与DNA1-R如SEQ ID NO：4-5所示：
8.根据权利要求5所述的DNA1转基因植物培育方法，其特征在于：所述引物DNA1-qFor和DNA1-qRev的序列如SEQ ID NO：6-7所示：
...【技术特征摘要】
1.卫星病毒dna1在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述卫星病毒dna1序列如seq id no:1所示，所述病毒为双生病毒科病毒。
2.根据权利要求1所述的卫星病毒dna1在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述双生病毒科病毒包括番茄黄化曲叶病毒和甜菜严重曲顶病毒。
3.根据权利要求2所述的卫星病毒dna1在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌感染叶片外植体并短期共培养的方式，将dna1导入目的植物中，获得的本氏烟dna1高表达植物能够显著减轻双生病毒科病毒的侵染，抑制双生病毒科病毒侵染所造成的病害。
4.一种抗双生病毒毒科病毒的dna1转基因植物培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法将卫星...
【专利技术属性】
技术研发人员：李方方，胡广敏，周雪平，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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