【技术实现步骤摘要】
本公开涉及酶工程，具体而言，涉及一种3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体、重组表达载体、重组工程菌及其应用。
技术介绍
1、3-甾酮-δ1-脱氢酶(ksdd)是甾体化合物微生物代谢的关键酶，负责催化3-酮基类甾体化合物a环上的c1,2位脱氢反应。甾体化合物a环c1,2位引入双键后，其抗炎活性成倍增加。例如，醋酸可的松经c1,2脱氢反应后生成的醋酸波尼松，其抗炎活性增加了3-4倍。目前临床上许多重要甾体化合物的生产过程中均涉及到微生物的甾体c1,2脱氢反应，因此，甾体c1,2脱氢反应是工业生产醋酸泼尼松及其同系物最有价值的一种反应，是工业上采取微生物转化法生产甾体药物的典型代表。
2、目前，研究过程中仍然存在野生菌株酶表达量低、重组菌株活性表达低等问题，在工业应用方面存在底物添加量低，酶用量高，转化时间长，转化效率低等问题。为了实现蛋白质3-甾酮-δ1-脱氢酶在工业上的低成本应用，高活性和高热稳定性是至关重要的。
3、公开号为cn118207174a的中国专利公开了一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体和工程菌及其构建方法与应用。在该专利中，通过对3-甾酮-δ1-脱氢酶的氨基酸序列中的突变位点进行氨基酸残基的替换，获得一种3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体，但是其催化活性和耐热性能仍有待提高。
4、需要说明的是，在上述
技术介绍
部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
1、本公开的目的在
2、根据本公开的第一个方面，提供一种3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体，所述突变体为野生型3-甾酮-δ1-脱氢酶的氨基酸序列的第255位和第311位氨基酸进行突变得到；
3、或者第311位和第324位氨基酸进行突变得到。
4、在以上技术方案的基础上，优选的，3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体为野生型3-甾酮-δ1-脱氢酶的氨基酸序列的第255位的谷氨酸突变为天冬酰酸，同时，第311位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体m1；
5、所述突变体m1的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6、在以上技术方案的基础上，优选的，3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体为野生型3-甾酮-δ1-脱氢酶的氨基酸序列的第311位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时，第324位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体m2；
7、所述突变体m2的氨基酸序列如seq id no.3所示。
8、根据本公开的第二个方面，提供一种重组表达载体，包括上述的突变体m1的编码基因，或者上述的突变体m2的编码基因。
9、在以上技术方案的基础上，优选的，所述突变体m1的编码基因由特异性引物对扩增获得；所述特异性引物对e225n-f/r和t311a-f/r分别为：
10、e225n-f tggcgcaataccaccctggttgaactggtgaccgaaggcg；
11、e225n-r tcaaccagggtggtattgcgccaaatcggaatgcctgcacgca；
12、t311a-f gatcaggcctggtggtttccggccgtggcaccgctgc；
13、t311a-r gccggaaaccaccaggcctgatccatcagggtcagttcg gc。
14、在以上技术方案的基础上，优选的，所述突变体m2的编码基因由特异性引物对扩增获得；所述特异性引物对t311a-f/r和t324a-f/r分别为：
15、t311a-f gatcaggcctggtggtttccggccgtggcaccgctgc；
16、t311a-r gccggaaaccaccaggcctgatccatcagggtcagttcggc；
17、t324a-f gtggtgcacctcaggttctgctggcagaacgcagcctgcc；
18、t324a-r agcagaacctgaggtgcaccacccggcagcggtgccacg。
19、在以上技术方案的基础上，优选的，所述重组表达载体为含有突变体m1编码基因或含有突变体m2编码基因的质粒、噬菌体或病毒载体。
20、更进一步优选的，所述重组表达载体为pet28a质粒；
21、所述pet28a质粒包括sumo融合蛋白标签和突变体m1编码基因；
22、或者，所述pet28a质粒包括sumo融合蛋白标签和突变体m2编码基因。
23、根据本公开的第三个方面，提供一种表达上述突变体m1或突变体m2的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌通过将上述重组表达载体转染至宿主细菌中获得。
24、在以上技术方案的基础上，优选的，所述宿主细菌为大肠杆菌bl21。
25、根据本公开的第四个方面，提供上述的重组工程菌在制备甾体药物中的应用。
26、有益效果：本专利技术通过对3-甾酮-δ1-脱氢酶的氨基酸序列进行改造，获得突变位点为e225n和t311a的突变体m1，及突变位点为t311a和t324a的突变体m2。与野生型相比，突变体m1和突变体m2均具有较高的催化活性和较高的热稳定性。如此，可以使得具有突变体m1或突变体m2的重组工程菌再工业化使用时，提高底物添加量，同时降低酶的使用量，提高底物的转化率。
27、突变体m1的比酶活较野生型提高到221.2％，催化效率(kcat/km)提高到168.4％，半失活温度提高了11.8℃，且30℃下的半衰期为21.5小时，较野生型增加了6.9倍。突变体m2的比酶活较野生型提高到393.9％，催化效率(kcat/km)提高到401.6％，半失活温度提高了14.0℃，且30℃下的半衰期为12.9小时，比wt增加了4.2倍。两种突变体在醋酸可的松(ca)转化为醋酸泼尼松(pa)的工业生产上均表现出更高浓度的底物添加量、更低浓度的酶用量和更快的转化效率，为其工业应用奠定了基础。
28、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
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1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶的突变体，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的突变体，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的突变体，其特征在于：
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的突变体M1的编码基因，或者权利要求3所述的突变体M2的编码基因。
5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述突变体M1的编码基因由特异性引物对扩增获得；所述特异性引物对E225N-F/R和T311A-F/R分别为：
6.根据权利要求4-5任意一项所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为含有突变体M1编码基因或含有突变体M2编码基因的质粒、噬菌体或病毒载体。
7.根据权利要求6所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET28a质粒；
8.一种表达权利要求2或3所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶的突变体的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌通过将权利要求4-7任意一项所述的重组表达载体转染至宿主细菌中获得。
9.根据权利要求
10.权利要求8或9所述的重组工程菌在制备甾体药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶的突变体，其特征在于：
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的突变体m1的编码基因，或者权利要求3所述的突变体m2的编码基因。
5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述突变体m1的编码基因由特异性引物对扩增获得；所述特异性引物对e225n-f/r和t311a-f/r分别为：
6.根据权利要求4-5任意一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张蓉，罗欣然，徐子捷，王小俊，系祖斌，李明磊，姚立成，
申请(专利权)人：湖北共同甾体药物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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