【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一组调控番茄对灰霉病抗性的基因及其应用。
技术介绍
1、番茄灰霉病(gray mold disease)是番茄生产中危害最严重的病害之一，一般可使番茄产量减产10％～20％，严重时会减产30％～60％，对番茄的产量和效益影响甚大。其病原灰葡萄孢(botrytis cinerea pers.)还可侵染葡萄、黄瓜、草莓等200余种作物，产生软腐、黑腐、霉变等症状，造成重大经济损失。番茄抗灰霉病的研究虽已取得了一定进展，但仍存在一些关键问题尚未解决。早在2009年davis等人就利用渐渗系定位了一些抗灰霉病的qtls位点，但是时至今日，番茄抗灰霉病的主效抗性基因还没有被克隆出来。因此，利用基因工程手段研究番茄对灰霉病的抗性机制，对于有效的防治灰霉病病害、促进番茄产业的健康发展具有重要意义。
2、在受到灰霉菌的感染过程中，番茄对灰霉病菌的抗性机制主要包括物理屏障和受病原物诱导生化物质及免疫基因构成的。物理屏障是植物本身所具有的抗性结构和物质，而生化物质和免疫基因主要指由于病菌侵染诱导植物产生的免疫反应和抗性相关信号途径及防卫基因的表达等。叶绿体作为植物特有的进行光合作用的细胞器，在调节植物对防御响应中也起着核心作用。大量研究证实了叶绿体在植物免疫反应中的基本功能：植物感知危险信号后，叶绿体作为钙信号和活性氧信号的来源，将信号传递到细胞核，导致防御相关基因(比如水杨酸、茉莉酸等合成相关基因)的表达以及病原体模式分子触发的免疫反应(pattern-triggered immunity，pti)激活
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提供一组调控番茄对灰霉病抗性的基因及其应用。
2、本专利技术目的之一在于提供一组调控番茄对灰霉病抗性的基因，所述基因为番茄slbiupa基因和番茄slbiupb基因；
3、其中，所述番茄slbiupa基因核苷酸序列如seq id no.1所示，或与seq id no.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码如seq id no.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
4、所述番茄slbiupb基因核苷酸序列如seq id no.3所示，或与seq id no.3所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码如seq id no.4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
5、本专利技术目的之二在于提供上述基因在番茄对灰霉病抗性调控中的应用，所述应用具体体现为：当在番茄中超量表达slbiupa基因或slbiupb基因时，番茄对灰霉病抗性显著降低；当分别单独敲除slbiupa基因或slbiupb基因均能提高番茄对灰霉病抗性；当同时敲除slbiupa基因和slbiupb基因时能进一步提高番茄对灰霉病抗性。
6、进一步地，当分别单独敲除slbiupa基因或slbiupb基因时均能使番茄对灰霉病抗性增强12％～23％；当同时敲除slbiupa基因和slbiupb基因时能使番茄对灰霉病抗性增强45％～48％。
7、本专利技术目的之三在于提供表达上述基因所编码的蛋白的表达载体，所述表达载体含有番茄slbiupa基因或番茄slbiupb基因。
8、进一步地，当构建含有番茄slbiupa基因的表达载体时扩增slbiupa基因的引物如seq id no.5所示，具体如下：
9、slbiupa-oe-fw:5’-catttggagaggacacgctcgagatggc tgacccgaatcgac-3’；
10、slbiupa-oe-rv:5’-tctcattaaagcaggactctagatcacag cccaactcgacactgcct-3’。
11、当构建含有番茄slbiupb基因的表达载体时扩增slbiupb基因的引物如seq idno.6所示，具体如下：
12、slbiupb-oe-fw:5’-catttggagaggacacgctcgagatgaa cgacccaaatcggc-3’；
13、slbiupb-oe-rv:5’-tctcattaaagcaggactctagatcagag gccaacccggca-3’。
14、本专利技术目的之四在于提供一种编辑上述基因的编辑重组载体，所述编辑重组载体是利用crispr/cas9技术构建的基因表达框失活的重组载体，编辑重组载体具体为番茄slbiupa基因编辑重组载体、番茄slbiupa基因编辑重组载体和番茄slbiupa+slbiupb基因编辑重组载体；
15、其中，番茄slbiupa基因中的两个靶点序列分别如seq id no：7和seq id no：8所示；番茄slbiupb基因中的两个靶点序列分别如seq id no：9和seq id no：10所示；所述番茄slbiupa+slbiupb基因编辑重组载体中两个靶点序列分别如seq id no：7和seq id no：9所示。
16、具体的，seq id no：7为slbiupa靶点1，具体序列为：gtaa acgagactacccagg；
17、seq id no：8为slbiupa靶点2，具体序列为：ctcctcctcc taaccacaa；
18、seq id no：9为slbiupb靶点1，具体序列为：gcaccgccg ccaaaccctaa；
19、seq id no：10为slbiupb靶点2，具体序列为：ccgagtgat cggtatggcta。
20、进一步地，当构建番茄slbiupa基因编辑重组载体时所用扩增敲除靶点的引物序列如seq id no.11所示，具体如下：
21、slbiupa-ko-fw:5’-gaatctaacagtgtagtttggtaaacgagactacccagggttttagagctagaaatagc-3’；
22、slbiupa-ko-rv:5’-gctatttctagctctaaaacttgtggttaggaggaggagcaaactacactgttagattc-3’。
23、当构建番茄slbiupb基因编辑重组载体时所用扩增敲除靶点的引物序列如seq idno.12所示，具体如下：
24、slbiupb-ko-fw:5’-gaatctaacagtgtagtttggcaccgccgccaaaccctaagttttagagctagaaatag-3’；
25、slbiupb-ko-rv:5’-gctatttctagctctaaaacccgagtgatcggtatggctacaaactacactgttagatt-3’。
26、当构建番茄slbiupa+slbiupb基因编辑重组载体时所用扩增敲除靶点的引物序列如seq id no.13所示，具体如下：
27、dko-fw：5’-gaa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组调控番茄对灰霉病抗性的基因，其特征在于，所述基因为番茄SlBIUPa基因和番茄SlBIUPb基因；
2.权利要求1所述基因在番茄对灰霉病抗性调控中的应用，其特征在于，所述应用具体体现为：当在番茄中超量表达SlBIUPa基因或SlBIUPb基因时，番茄对灰霉病抗性显著降低；当分别单独敲除SlBIUPa基因或SlBIUPb基因均能提高番茄对灰霉病抗性；当同时敲除SlBIUPa基因和SlBIUPb基因时能进一步提高番茄对灰霉病抗性。
3.一种表达权利要求1所述基因编码的蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有番茄SlBIUPa基因或番茄SlBIUPb基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，当构建含有番茄SlBIUPa基因的表达载体时扩增SlBIUPa基因的引物如SEQ ID NO.5所示；
5.一种权利要求1所述基因的编辑重组载体，其特征在于，所述编辑重组载体是利用CRISPR/Cas9技术构建的基因表达框失活的重组载体，编辑重组载体具体为番茄SlBIUPa基因编辑重组载体、番茄SlBIUPa基因编辑重组载体和番
6.根据权利要求5所述的编辑重组载体，其特征在于，当构建番茄SlBIUPa基因编辑重组载体时所用扩增敲除靶点的引物序列如SEQ ID NO.11所示；
7.一种调控番茄对灰霉病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中鉴定表达载体转入至农杆菌阳性克隆所用引物分别为：前引物CaMV 35S和SEQ ID NO.5的后引物；前引物CaMV 35S和SEQ IDNO.6的后引物；
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2中鉴定阳性苗超量表达情况所用引物序列如SEQ ID NO.15所示；
...【技术特征摘要】
1.一组调控番茄对灰霉病抗性的基因，其特征在于，所述基因为番茄slbiupa基因和番茄slbiupb基因；
2.权利要求1所述基因在番茄对灰霉病抗性调控中的应用，其特征在于，所述应用具体体现为：当在番茄中超量表达slbiupa基因或slbiupb基因时，番茄对灰霉病抗性显著降低；当分别单独敲除slbiupa基因或slbiupb基因均能提高番茄对灰霉病抗性；当同时敲除slbiupa基因和slbiupb基因时能进一步提高番茄对灰霉病抗性。
3.一种表达权利要求1所述基因编码的蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有番茄slbiupa基因或番茄slbiupb基因。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，当构建含有番茄slbiupa基因的表达载体时扩增slbiupa基因的引物如seq id no.5所示；
5.一种权利要求1所述基因的编辑重组载体，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王涛涛，孙文慧，罗丹，华兵，叶志彪，张俊红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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