【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程，具体涉及提供了一种新型冠状病毒特异性的以分泌il-17a为主的cd4+t细胞的表位肽及其应用。
技术介绍
1、面对新冠带来的危害，找到有效的疫苗是经济有效手段。
2、变异株出现给疫苗带来严重威胁。新冠病毒持续变异和传播，在多个国家和地区流行，其中delta和omicron具有较强的传染性。delta突变毒株有着传播速度快、传播范围广、体内繁殖快、病人康复时间长等特点，该突变可以降低体内抗体中和能力，进行免疫逃逸，从而降低疫苗的有效率。omicron突变毒株有着较强的传播能力，其s蛋白突变位点较多，因此严重影响利用s蛋白刺激人体产生免疫保护作用的疫苗。以上突变不仅增加新冠病毒致病性，也影响着宿主免疫调控，使疫苗的保护率大为减低。
3、t细胞应答在清除新冠病毒方面发挥着至关重要的作用。当新冠病毒入侵时，体内的cd4+t细胞通常分化为th1和tfh细胞。th1细胞可以分泌ifn-γ等细胞因子，可以起到抗病毒作用。tfh可以辅助b细胞形成生发中心，在长期的体液应答和中和抗体中起到关键作用。cd4+t还可以分化为th17细胞，分泌il-17a，参与固有免疫和炎症反应，主要引起免疫损伤。此外，新冠特异性cd4+t细胞中还能检测到il-22和黏膜组织修复相关的ccr6，其提示cd4+t细胞在新冠感染时参与肺组织的修复。在恢复期，约70％的covid-19(corona virusdisease 2019，新型冠状病毒感染)患者检测到病毒特异性cd8+t杀伤细胞，而约100％人群均可检
4、新型冠状病毒由核衣壳蛋白、膜蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白组成的外膜包裹。其中，sars-cov-2表面刺突蛋白(spike protein,s蛋白)是介导病毒入侵的关键蛋白，与新冠病毒传染能力和发病机制息息相关。在感染过程中，s蛋白被宿主蛋白酶切割为n端的s1亚基和c端的s2亚基。其中，s1亚基可进一步分为相对独立的ntd(n-terminal domain，n-端区域)和ctd(c-terminal domain，c-端区域)。s蛋白的受体结合域(receptor bindingdomain,rbd)多位于ctd区域，通过与人体细胞的ace2(angiotension converting enzyme2,血管紧张素转化酶2)结合介导病毒进入细胞，是决定组织嗜性和宿主范围的关键。新冠病毒的rbd抗原是免疫显性的，是新冠病毒免疫血清里90％中和抗体的靶点。当rbd结构发生改变时，病毒的种属和感染特异性都会发生相应改变。此外，rbd容易表达和纯化，是目前新型冠状病毒疫苗设计的主要靶点。因此，研究rbd抗原的cd4+t细胞广谱免疫优势表位及其免疫保护机制，对研究广谱的新冠疫苗显得尤为重要。
5、迄今为止，尽管已有关于新冠病毒及其s蛋白的t细胞表位的研究报道，但是这些已有研究仅含对rbd部分t细胞表位的报道，对rbd抗原的cd4+t细胞应答也均停留在个别表位应答分析和生物信息学层面，先前的研究均未深入、系统分析rbd的cd4+t细胞的优势应答。
6、佐剂是疫苗的非特异性的免疫增强剂，与抗原一同注入机体后，能够增强抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。本研究中应用到addavax和addas03两种佐剂。addavax配方与mf59相似，是一种基于角鲨烯的o/w纳米乳佐剂。角鲨烯是一种容易代谢且生物相容性较好的油，可以解决传统乳佐剂毒性大的问题这类佐剂被认为是通过募集和激活apcs以及刺激吞噬细胞和粒细胞产生细胞因子和趋化因子来起作用的，是细胞和体液免疫应答的有效刺激剂。addas03佐剂是一种o/w纳米乳液佐剂，由角鲨烯、dl-α-生育酚，以及表面活性剂吐温80组成。其中，添加的dl-α-生育酚可以通过调节某些趋化因子和细胞因子的表达以及抗原的摄取来提高抗原免疫应答能力。
7、尽管宿主细胞表达多种mhc分子且能对多种抗原肽识别并结合，但在病毒感染后，大部分的t细胞群只靶向某些肽，即体内免疫应答的产生大多针对其中的免疫优势表位，该现象即为“免疫优势”。所以，优势表位才是全抗原引起免疫应答的关键。
8、因此，rbd抗原免疫优势表位的研究是揭示基于rbd抗原的新冠疫苗的分子作用机制的关键，对于设计广谱新冠疫苗显得尤为重要。酶联免疫斑点技术(enzyme linkedimmunospot assay，简称elispot)对细胞因子的检测有着较高的分辨率、特异性、可信度。因此项目将elispot技术作为研究方法来检测t细胞分泌的细胞因子，研究addavax和addas03佐剂辅助下rbd诱发的以诱导分泌il-17a为主的cd4+t细胞表位，筛选具有免疫优势的保护性t细胞表位能为疫苗的研发提供潜在靶点。
9、综上可见，制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(rbd)，证实其抗血清在不同新型冠状病毒毒株中的中和能力，并进一步筛选rbd的优势应答表位，将为优化sars-cov-2疫苗的研发提供坚实的理论基础，并利于在人群中预防新冠病毒病，对疫苗效果评估及新型冠状病毒感染诊断试剂开发。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的首要目的是提供一种新型冠状病毒特异性的重要保护性抗原rbd的cd4+t细胞表位肽。本专利技术围绕sars-cov-2病毒的重要保护性抗原特异性cd4+t细胞表位肽进行研究，本专利技术制备了新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(rbd)，通过动物免疫抗血清中和多种变异株实验证实了其保护能力，并通过覆盖rbd全长的重叠肽的酶联免疫斑点技术(elispot)筛选出rbd的cd4+t细胞表位肽。
2、本专利技术公开了一种用于新型冠状病毒保护性抗原表位肽，其包含氨基酸序列选自seq id no:14、seq id no:18、seq id no:29和seq id no:32中的一种或多种的肽段。
3、本专利技术还提供了上述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗sars-cov-2感染的疫苗中的应用。
4、本专利技术进一步提供了将上述抗原表位肽作为抗sars-cov-2感染药物筛选靶标的应用。
5、本专利技术的另一方面，提供了一种用于预防或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，其包含上述的抗原表位肽，以及药学上可接受的辅料。
6、在根据本专利技术的一个实施方案中，上述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于新型冠状病毒保护性抗原表位肽，其特征在于，其包含氨基酸序列选自SEQID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32中的一种或多种的肽段。
2.如权利要求1所述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的抗原抗原表位肽作为抗SARS-CoV-2感染药物筛选靶标的应用。
4.一种用于预防或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的抗原表位肽，以及药学上可接受的辅料。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，还包含佐剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述佐剂为AddaS03和/或AddaVax。
7.如权利要求4-6中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述新型冠状病毒为SARS-CoV-2。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为经鼻施用的剂型；优选为喷雾剂、滴鼻剂、粉末剂、凝胶制剂或微球制剂。
9.一种多肽
10.一种用于新型冠状疫苗效果评估或用于新型冠状病毒感染诊断的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的抗原表位肽。
...【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒保护性抗原表位肽，其特征在于，其包含氨基酸序列选自seqid no:14、seq id no:18、seq id no:29和seq id no:32中的一种或多种的肽段。
2.如权利要求1所述的抗原表位肽在制备用于预防或治疗sars-cov-2感染的疫苗中的应用。
3.权利要求1所述的抗原抗原表位肽作为抗sars-cov-2感染药物筛选靶标的应用。
4.一种用于预防或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的抗原表位肽，以及药学上可接受的辅料。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，还包含佐剂。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵卓，王天芮，明光阳，燕鹏举，章金勇，陈龙龙，邹全明，段连礼，陈致富，苟强，王晓琼，敬海明，李思思，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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