【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种dna适配体核酸分子，该适配体核酸分子用于检测核酸分子与蛋白质活性的检测方法以及包含该适配体及其复合物的试剂盒。本专利技术的适配体可以特异性结合荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。
技术介绍
1、中心法则是分子生物学最基本最重要的理论之一，它说明了遗传信息的传递方向和遗传信息的表达。dna中的碱基的排列顺序构成了遗传信息。该遗传信息可以通过转录过程形成rna，然后其中的mrna通过翻译产生多肽，形成蛋白质，蛋白质的生物合成和生物性状的表现(新陈代谢、生长发育、组织分化等)都直接与dna紧密相关。dna是构成基因与表达的物质基础，是组成细胞的重要生理活性物质，它支配着生命从诞生到死亡的全过程。
2、核酸适配体(aptamer)是通过selex技术得到的单链核糖核酸(rna)或单链脱氧核糖核酸(dna)。可以理解为核酸组成的抗体，单链dna或者rna在没有互补链存在的情况下，自身经过卷曲和折叠形成特定的三级结构，并形成具备一定功能的分子，功能类似抗体。但是适配体与抗体相比有很多的区别，适配体具有较高的连接特异性、吸附力和相对较小、缺乏免疫原性、易合成、易储存、可进行多种修饰和高稳定性等独特的优势。
3、dna是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础。由于对每一种生物体来说，核酸的序列都是独一无二的。因此，在诊断和识别各种疾病时，这些细菌、病毒、病原体的核酸序列就成为了研究对象。目前，很多疾病的序列信息已被人们掌握，为了能够有效抗击这些疾病，及早和准确地探测dna序列显
4、从grodjicker在l974年创立rflp(restriction fragment lengthpolymorphisms)技术以来，短短二十多年，dna分子标记发展迅速，且种类繁多，特点各异。目前，分子标记技术依其所使用的主要分子生物学技术，大致可分为以传统分子杂交技术为基础的分子标记技术、以pcr为基础的分子标记技术和随机引物pcr。dna分子标记目前在研究上还存在许多缺点和不足：分子标记的种类应用不平衡且灵敏度不够，成本高。核酸适配体本身不发光，需要在反应体系中引入荧光基团引发光信号变化从而进行检测。核酸适配体可以通过标记型和免标记型两类方法产生荧光，其中标记型由于检测灵敏度高、快速响应、可选择标记种类多、具备多重和实时检测能力而成为首选；同时由于核酸适配体具有丰富的功能基团，也经常和多种荧光物质进行无标记的结合；两种方法都有着较为广泛的应用。相较于标记法，免标记的方法更加方便，且成本更低，荧光标记可能对靶标与适配体之间亲和性产生一定影响，因此非荧光标记的荧光适配体生物传感器技术得以发展。本文荧光dna适配体是指一类能够特异性地结合荧光团等小分子物质、诱导和增强其发光的物质，当荧光团分子嵌入dna适配体形成的结合口袋时，分子内运动被阻碍，从而实现人造荧光dna。
5、科学家们构建了一个荧光团-淬灭剂结合体，当荧光团的适配体(aptamer)与荧光团结合时，淬灭剂就不能将荧光团的荧光信号淬灭，此时适配体-荧光团-淬灭剂构成的复合物是有荧光的。当荧光团的适配体不存在时，荧光团的荧光信号就会被淬灭剂淬灭。基于这样的原理，科学家们实现了对细菌中mrna的成像。此外，人们还开发了一个称为image的标签，它由两种不同的适配体-小分子复合物构成。当小分子结合到rna序列中的适配体上时，相邻的两个小分子所携带的荧光团就会发生荧光共振能量转移(fret)现象，通过检测荧光信号的变化就可以检测细胞中dna或者rna的情况。
6、发光的荧光染料表现出优异的性能，即自发荧光非常低，但与适配体相互作用时荧光会大大增加。有机小分子荧光染料多为芳香族化合物，一般情况下具有大的π共轭体系、刚性平面结构和较强的电子基团，这些性质对荧光产生比较有利。不同结构荧光小分子的荧光发射位置不同，对结构进行调整或者引入其他基团都可能引起荧光发射性能的改变。因此，通过改变有机小分子染料的性能可以实现不同检测波长的荧光dna适配体的开发。例如：香豆素类小分子及其衍生物，其发射光谱通常在蓝光区域，荧光素及罗丹明类小分子发射光谱则在绿光、黄光及橙光区域，而苯并吡喃衍生物及花青素类小分子发射光谱在红光及近红外光区域。开发荧光染料适配体将极大地促进用于各种检测目的的无标记探针的开发。
7、在过去的几年里，荧光dna适配体已经成为基于基因编码的荧光生物传感器，用于细胞成像和检测各种目标靶标。荧光探针在细胞生物学和生物医学成像技术的发展中起着核心作用。通过激发光与识别元件的相互作用来反应待测物浓度及其他信息，荧光强度、衰减速率和光谱形状都可以单独或结合作为信号检测手段，具有快速准确、多靶标、高灵敏度、仪器简单等优势。到目前为止，已经将大量基于强度或比率的小分子荧光化合物构建到传感器中。各种染料，例如荧光素，罗丹明，bodipy和cyanine，已被用作这些小分子传感器中的报告分子。
8、对于dna、rna、生物小分子或者生物大分子的检测，有一种方法是实时定量聚合酶链反应(qpcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次pcr循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。qpcr扩增方法因其灵敏度高而被广泛应用于生物分子的检测中。但是其缺点和局限性在于qpcr需要价格昂贵的探针标签以及专业的仪器设备和专门的技术人员进行操作，目前基于rca的放大检测技术，是一种等温、由某些dna聚合酶(如phi29 dna聚合酶)介导的酶放大过程，将dntps转化为单链dna分子，该分子包含数十个或数百个带有13-240个核苷酸的环状模板链的连续重复拷贝。rca技术具有灵敏度高、扩增产率高等优点，因此在dna、蛋白质等的检测中具有广阔的应用前景。
9、第一条非g-四联体荧光dna适配体发现于2016年东京工业大学的研究团队，t.kato等人报道了一种42-mer的dna适配体(dap-10-42)，它与环境敏感的dapoxyl衍生物结合并增强了其荧光。dap-10-42适配体可以融合到其他结合分析物的适配体中。他们设计并开发了两种不同的“开启”传感器，它们可以检测凝血酶或三磷酸腺苷，并且这些与使用荧光g-四联体配体报道的无标记传感器相当。证明了dap-10-42作为信号模块的多功能性，这些传感器是通过简单地去除分析结合适配体和dap-10-42之间茎的碱基对来设计的，茎序列的进一步优化可能会提高它们的准确性。此外，还表明了其他报道的含有适当茎连接到dap-10-42的dna适配体通常也可用于构建新的传感器，大大扩展了这类适配体的用处，开创了非g-四联体传感器的应用，弥补了g-四联体在稳定性和结构方面的不足。最近，r.p.connelly等人报道了dap-1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的Avocado结构核苷酸序列具有至少88％，90％，93％，95％，98％或100％同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的Avocado结构核苷酸序列中不包括N1和N44的位置，经过5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。
4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1和N44的位置，经过2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N1与N44互补配对时，N1核苷酸序列的方向为5’-3’，N44核苷酸序列的方向为3’-5’。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当N1与N28中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N1与N44核苷
7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式Avocado结构的核苷酸取代选自下组中的一种：C2A、C2T、C2G、A3T、A3C、A3G、C4A、C4T、C4G、T5A、T5C、T5G、C6A、C6T、C6G、C7A、C7T、C7G、G8A、G8C、G8T、T9A、T9C、T9G、T10A、T10C、T10G、G11T、G12A、G12C、G12T、T13A、T13C、T13G、T14A、T14C、T14G、G15A、C18A、C18T、C18G、T19A、T19C、C20A、A21T、A21C、A21G、T22A、T22C、T22G、C23A、C23T、C23G、G27A、G27C、G27T、G33A、G33T、G33C、G34A、G34C、G34T、A37T、A37C、A37G、C38A、C38T、C38G、A39T、A39C、A39G、T40A、T40C、T40G、C41A、C41T、C41G、T42A、T42C、T42G、C43A、C43T、C43G、T5C/T9C、T5C/T13C、T5C/G34C、T5C/C38G、T5C/T40G、T5C/C41G、T5C/T42C、T9C/T13C、T9C/G34C、T9C/C38G、T9C/T40G、T9C/C41G、T9C/T42C、T13C/G34C、T13C/C38G、T13C/T40G、T13C/C41G、T13C/T42C、G34C/C38G、G34C/T40G、G34C/C41G、G34C/T42C、C38G/T40G、C38G/C41G、C38G/T42C、T40G/C41G、T40G/T42C、C41G/T42C、T5C/T9C/T13C、T5C/T9C/G34C、T5C/T9C/C38G、、T5C/T9C/T40G、T5C/T9C/C41G、T5C/T9C/T42C、T5C/T13C/G34C、T5C/T13C/C38G、T5C/T13C/T40G、T5C/T13C/C41G、T5C/T13C/T42C、T5C/G34C/C38G、T5C/G34C/T40G、T5C/G34C/C41G、T5C/G34C/T42C、T5C/C38G/T40G、T5C/C38G/C41G、T5C/C38G/T42C、T5C/T40G/C41G、T5C/T40G/T42C、T5C/C41G/T42C、T9C/T13C/G34C、T9C/T13C/C38G、T9C/T13C/T40G、T9C/T13C/C41G、T9C/T13C/T42C、T9C/G34C/C38G、T9C/G34C/T40G、T9C/G34C/C41G、T9C/G34C/T42C、T9C/C38G/T40G、T9C/C38G/C41G、T9C/C38G/T42C、T9C/T40G/C41G、T9C/T40G/T42C、T9C/C41G/T42C、T13C/G34C/C38G、T13C/G34C/T40G、T13C/G34C/C41G、T13C/G34C/T42C、T13C/C38G/T40G、T13C/C38G/C41G、T13C/C38G/T42C、T13C/T40G/C41G、T13C/T40G/T42C、T13C/C41G/T42C、G34C/C38G/T40G、G34C/C38G/C41G、G34C/C38G/T42C、G34C/T40G/C41G、G34C/T40G/T42C、G34C/C41G/T42C、C38G/T40G/C41G、C38G/T4...
【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的avocado结构核苷酸序列具有至少88％，90％，93％，95％，98％或100％同一性的序列。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的avocado结构核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。
4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1和n44的位置，经过2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n44互补配对时，n1核苷酸序列的方向为5’-3’，n44核苷酸序列的方向为3’-5’。
6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当n1与n28中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n1与n44核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对。
7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式avocado结构的核苷酸取代选自下组中的一种：c2a、c2t、c2g、a3t、a3c、a3g、c4a、c4t、c4g、t5a、t5c、t5g、c6a、c6t、c6g、c7a、c7t、c7g、g8a、g8c、g8t、t9a、t9c、t9g、t10a、t10c、t10g、g11t、g12a、g12c、g12t、t13a、t13c、t13g、t14a、t14c、t14g、g15a、c18a、c18t、c18g、t19a、t19c、c20a、a21t、a21c、a21g、t22a、t22c、t22g、c23a、c23t、c23g、g27a、g27c、g27t、g33a、g33t、g33c、g34a、g34c、g34t、a37t、a37c、a37g、c38a、c38t、c38g、a39t、a39c、a39g、t40a、t40c、t40g、c41a、c41t、c41g、t42a、t42c、t42g、c43a、c43t、c43g、t5c/t9c、t5c/t13c、t5c/g34c、t5c/c38g、t5c/t40g、t5c/c41g、t5c/t42c、t9c/t13c、t9c/g34c、t9c/c38g、t9c/t40g、t9c/c41g、t9c/t42c、t13c/g34c、t13c/c38g、t13c/t40g、t13c/c41g、t13c/t42c、g34c/c38g、g34c/t40g、g34c/c41g、g34c/t42c、c38g/t40g、c38g/c41g、c38g/t42c、t40g/c41g、t40g/t42c、c41g/t42c、t5c/t9c/t13c、t5c/t9c/g34c、t5c/t9c/c38g、、t5c/t9c/t40g、t5c/t9c/c41g、t5c/t9c/t42c、t5c/t13c/g34c、t5c/t13c/c38g、t5c/t13c/t40g、t5c/t13c/c41g、t5c/t13c/t42c、t5c/g34c/c38g、t5c/g34c/t40g、t5c/g34c/c41g、t5c/g34c/t42c、t5c/c38g/t40g、t5c/c38g/c41g、t5c/c38g/t42c、t5c/t40g/c41g、t5c/t40g/t42c、t5c/c41g/t42c、t9c/t13c/g34c、t9c/t13c/c38g、t9c/t13c/t40g、t9c/t13c/c41g、t9c/t13c/t42c、t9c/g34c/c38g、t9c/g34c/t40g、t9c/g34c/c41g、t9c/g34c/t42c、t9c/c38g/t40g、t9c/c38g/c41g、t9c/c38g/t42c、t9c/t40g/c41g、t9c/t40g/t42c、t9c/c41g/t42c、t13c/g34c/c38g、t13c/g34c/t40g、t13c/g34c/c41g、t13c/g34c/t42c、t13c/c38g/t40g、t13c/c38g/c41g、t13c/c38g/t42c、t13c/t40g/c41g、t13c/t40g/t42c、t13c/c41g/t42c、g34c/c38g/t40g、g34c/c38g/c41g、g34c/c38g/t42c、g34c/t40g/c41g、g34c/t40g/t42c、g34c/c41g/t42c、c38g/t40g/c41g、c38g/t40g/t42c、c38g/c41g/t42c、t40g/c41g/t42c、t5c/t9c/t13c/g34c、t5c/t9c/t13c/c38g、t5c/t9c/t13c/t40g、t5c/t9c/t13c/c41g、t5c/t9c/t13c/t42c、t5c/t9c/g34c/c38g、t5c/t9c/g34c/t40g、t5c/t9c/g34c/c41g、t5c/t9c/g34c/t42c、t5c/t9c/c38g/t40g、t5c/t9c/c38g/c41g、t5c/t9c/c38g/t42c、t5c/t9c/t40g/c41g、t5c/t9c/t40g/t42c、t5c/t9c/c41g/t42c、t5c/t13c/g34c/c38g、t5c/t13c/g34c/t40g、t5c/t13c/g34c/c41g、t5c/t13c/g34c/t42c、t5c/t13c/c38g/t40g、t5c/t13c/c38g/c41g、t5c/t13c/c38g/t42c、t5c/t13c/t40g/c41g、t5c/t13c/t40g/t42c、t5c/t13c/c41g/t42c、t5c/g34c/c38g/t40g、t5c/g34c/c38g/c41g、、t5c/g34c/c38g/t42c、t5c/g34c/t40g/c41g、t5c/g34c/t40g/t42c、t5c/g34c/c41g/t42c、t5c/c38g/t40g/c41g、t5c/c38g/t40g/t42c、t5c/t40g/c41g/t42c、t9c/t13c/g34c/c38g、t9c/t13c/g34c/t40g、t9c/t13c/g34c/c41g、t9c/t13c/g34c/t42c、t9c/t13c/c38g/t40g、t9c/t13c/c38g/c41g、t9c/t13c/c38g/t42c、t9c/t13c/t40g/c41g、t9c/t13c/t40g/t42c、t9c/t13c/c41g/t42c、t9c/g34c/c38g/t40g、t9c/g34c/c38g/c41g、t9c/g34c/c38g/t42c、t9c/g34c/t40g/c41g、t9c/g34c/t40g/t42c、t9c/g34c/c41g/t42c、t9c/c38g/t40g/c41g、t9c/c38g/t40g/t42c、t9c/c38g/c41g/t42c、t9c/t40g/c41g/t42c、t13c/g34c/c38g/t40g、t13c/g34c/c38g/c41g、t13c/g34c/c38g/t42c、t13c/g34c/t40g/c41g、t13c/g34c/t40g/t42c、t13c/g34c/c41g/t42c、t13c/c38g/t40g/c41g、t13c/c38g/t40g/t42c、t13c/c38g/c41g/t42c、g34c/c38g/t40g/c41g、g34c/c38g/t40g/t42c、c38g/t40g/c41g/t42c、t5c/t9c/t13c/g34c/c38g、t5c/t9c/t13c/g34c/t40g、t5c/t9c/t13c/g34c/c41g、t5c/t9c/t13c/g34c/t42c、t5c/t9c/t13c/c38g/t40g、t5c/t9c/t13c/c38g/c41g、t5c/t9c/t13c/c38g/t42c、t5c/t9c/t13c/t40g/c41g、t5c/t9c/t13c/t40g/t42c、t5c/t9c/t13c/c41g/t42c、t5c/t9c/g34c/c38g/t40g、t5c/t9c/g34c/c38g/c41g、t5c/t9c/g34c/c38g/t42c、t5c/t9c/g34c/t40g/c41g、t5c/t9c/g34c/t40g/t42c、t5c/t9c/g34c/c41g/t42c、t5c/t9c/c38g/t40g/c41g、t5c/t9c/c38g/t40g/t42c、t5c/t9c/c38g/c41g/t42c、t5c/t9c/t40g/c41g/t42c、t5c/t13c/g34c/c38g/t40g、t5c/t13c/g34c/c38g/c41g、t5c/t13c/g34c/c38g/t42c、t5c/t13c/g34c/t40g/c41g、t5c/t13c/g34c/t40g/t42c、t5c/t13c/g34c/c41g/t42c、t5c/t13c/c38g/t40g/c41g、t5c/t13c/c38g/t40g/t42c、t5c/t13c/c38g/c41g/t42c、t5c/t13c/t40g/c41g/t42c、t5c/g34c/c38g/t40g/c41g、t5c/g34c/c38g/t40g/t42c、t5c/g34c/c38g/c41g/t42c、t5c/c38g/t40g/c41g/t42c、t9c/t13c/g34c/c38g/t40g、t9c/t13c/g34c/c38g/c41g、t9c/t13c/g34c/c38g/t42c、t9c/t13c/g34c/t40g/c41g、t9c/t13c/g34c/t40g/t42c、t9c/t13c/g34c/c41g/t42c、t9c/t13c/c38g/t40g/c41g、t9c/t13c/c38g/t40g/t42c、t9c/t13c/c38g/c41g/t42c、t9c/t13c/t40g/c41g/t42c、t9c/g34c/c38g/t40g/c41g、t9c/g34c/c38g/t40g/t42c、t9c/g34c/c38g/c41g/t42c、t9c/c38g/t40g/c41g/t42c、t13c/g34c/c38g/t40g/c41g、t13c/g34c/c38g/t40g/t42c、t13c/g34c/c38g/c41g/t42c、t13c/g34c/t40g/c41g/t42c、g34c/c38g/t40g/c41g/t4...
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