【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗药物，尤其涉及一种car-间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、car具有抗体特异性识别功能，通常被用来装载到患者自体的免疫细胞(nk细胞、t细胞或巨噬细胞)上，细胞表面的car分子在识别表面抗原后会形成簇，并触发细胞内信号元件的募集。胞内信号转导尾部是一个组合结构域，该结构赋予效应细胞对靶细胞快速反应(杀伤和细胞因子释放)，可使效应细胞持续性激活和持续性对靶细胞产生效应。因此car能够使多克隆效应细胞群发生针对特异性抗原的重定向转化，特异性杀伤肿瘤细胞。
2、car-t疗法就是嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，英文全称chimeric antigenreceptort-cell immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。然而，这种高效的肿瘤治疗方法在临床治疗中也有一定的局限性，尤其是细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，crs)，部分患者会因其危及生命。目前临床上控制crs的主要手段包括使用il-6受体阻断剂托珠单抗注射液或者糖皮质激素，但是这些治疗手段具有一定的局限性，患者发生活动性感染时应用托珠单抗注射液会加重感染，而糖皮质激素的应用可能会影响car-t细胞的功能，因此探讨一种新的控制crs的策略十分必要。
3、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，mscs)
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服
技术介绍
中的缺陷，提供一种能够抗乳腺肿瘤的car-间充质干细胞外泌体。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种car-间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
4、s1.制备car-间充质干细胞，所述car-间充质干细胞包含car核苷酸序列，所述编码car核苷酸序列编码靶向ecad蛋白的嵌合抗原受体；
5、所述car核苷酸序列包含单链可变片段，还包括cd28或tlr4信号转导域；
6、s2.将car-间充质干细胞置于培养基中培养，所述培养基含有磁珠偶联的ecad蛋白；
7、s3.收集s2的培养上清液，进行梯度离心，梯度离心后取沉淀；
8、s4.将s3获得的沉淀重悬后与磁珠混合，进行孵育，然后置于磁场中，弃上清，再次重悬，将重悬液加入磁珠分选柱，用缓冲液对分选柱进行第一洗脱，待无抗原结合能力的外泌体囊泡冲洗下来后，将分选柱移出磁场，对洗脱液进行第二洗脱，收集第二洗脱后的洗脱液，获得car-间充质干细胞外泌体。
9、优选的，所述car核苷酸序列如seq id no:1所示，所述ecad蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
10、优选的，磁珠偶联的ecad蛋白在培养基中的浓度为50～100μg/ml，所述培养的时间为20～25h。
11、优选的，所述梯度离心具体包括：将培养上清液于1500～2500g离心8～12min，收集上清液1；然后将上清液1于9000～11000g离心15～25min，收集上清液2；再将上清液2于10000～12000g离心50～60min，获得沉淀。
12、优选的，s4所述磁珠为采用重组蛋白l包被的磁珠。
13、优选的，car-间充质干细胞的制备包括以下步骤：
14、1)构建含有car核苷酸序列的慢病毒；所述car核苷酸序列如seq id no:1所示；
15、2)将所述慢病毒转染至间充质干细胞中，获得car-间充质干细胞。
16、优选的，所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带血、脐带、胎盘或脂肪。
17、本专利技术还提供了制备方法制备得到的car-间充质干细胞外泌体。
18、本专利技术还提供了所述的car-间充质干细胞外泌体在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。
19、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术以人e钙粘蛋白为靶点，用包含car核苷酸序列的质粒包装重组慢病毒，然后用重组慢病毒感染间充质干细胞，获得car-间充质干细胞。然后将car-间充质干细胞以特异性的抗原活化产生外泌体后，进一步分离、富集、纯化，最终得到car-间充质干细胞外泌体。本专利技术制备的car-间充质干细胞具有抑制crs的能力，car-间充质干细胞外泌体能够抑制乳腺癌细胞和血管内皮细胞增殖，进而发挥抗乳腺肿瘤的作用，为乳腺癌的治疗提供了新的策略。
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1.一种CAR-间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CAR核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ECAD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，磁珠偶联的ECAD蛋白在培养基中的浓度为50～100μg/mL，所述培养的时间为20～25h。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述梯度离心具体包括：将培养上清液于1500～2500g离心8～12min，收集上清液1；然后将上清液1于9000～11000g离心15～25min，收集上清液2；再将上清液2于10000～12000g离心50～60min，获得沉淀。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S4所述磁珠为采用重组蛋白L包被的磁珠。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，CAR-间充质干细胞的制备包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带血、脐带、胎盘
8.根据权利要求1～7任意一种制备方法制备得到的CAR-间充质干细胞外泌体。
9.权利要求8所述的CAR-间充质干细胞外泌体在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种car-间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述car核苷酸序列如seq id no:1所示，所述ecad蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，磁珠偶联的ecad蛋白在培养基中的浓度为50～100μg/ml，所述培养的时间为20～25h。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述梯度离心具体包括：将培养上清液于1500～2500g离心8～12min，收集上清液1；然后将上清液1于9000～11000g离心15～...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨业国，苏晓萍，刘维康，王仕米，侯海燕，
申请(专利权)人：广东壹加再生医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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